項目九控制菌檢查及螨類檢查技術任務4藥品中大腸埃希菌檢查技能點1藥品中大腸埃希菌檢查試驗操作規(guī)程1.實訓目的掌握大腸埃希菌的檢查程序及注意事項。2.實訓要求2.1能按照下達的任務要求，完成大腸埃希菌檢查的試驗設計。2.2能根據(jù)試驗設計完成試驗的準備及試驗的具體操作。2.3能根據(jù)試驗反應的結(jié)果做出正確的結(jié)論。3.實驗前準備3.1儀器、設備和用具恒溫培養(yǎng)箱（30－35℃）、生化培養(yǎng)箱（23－28℃）、微波爐、電磁爐、勻漿儀、恒溫水浴、電熱干燥箱（250－300℃）、電冰箱、366nm紫外燈、蒸汽壓力滅菌器（使用時要進行生物指示劑滅菌效果檢查并應定期請有關部門檢定）。電子天平或天平（感量0.1g），pH系列比色計。藥品中大腸埃希菌檢查試驗操作規(guī)程錐形瓶、滴管、培養(yǎng)皿、試管、量筒、試管及塞、吸管、載玻片、蓋玻片、火柴、記號筆、酒精燈、酒精棉球或碘伏棉球。3.2培養(yǎng)基和試劑無菌氯化鈉溶液、無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液、無菌聚山梨酯80、大腸埃希菌、靛基質(zhì)、接種環(huán)、結(jié)晶紫、碘液、95%乙醇、沙黃染液培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基、MUG培養(yǎng)基、EMB3.2.10.9%無菌氯化鈉溶液：取氯化鈉9.0g，加水溶解至1000mL，121℃滅菌20min。3.2.2pH7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液：取磷酸二氫鉀3.56g，磷酸氫二鈉7.23g，氯化鈉4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000mL，微溫溶解，分裝，過濾，滅菌。藥品中大腸埃希菌檢查試驗操作規(guī)程3.2.3無菌聚山梨酯80氯化鈉溶液：取吐溫801mL加0.9%氯化鈉溶液至100mL，121℃滅菌20min。3.2.4靛基質(zhì)試液：取對二甲氨基苯甲醛10.0g，加入戊醇150g，充分振搖，完全溶解后，取濃鹽酸50mL徐徐滴入，邊加邊振搖，以免驟熱導致溶液色澤變深，置冰箱保存，備用。3.2.5沙黃染液：取沙黃0.25g，加95%的乙醇10mL，使完全溶解后，加水至100mL。3.2.6結(jié)晶紫染液：取結(jié)晶紫1.0g，加95%的乙醇20mL使溶解，加1%的草酸銨溶液80mL，混勻。靜置#23使用，置密閉棕色瓶中儲存。3.2.7碘試液：取碘化鉀2.0g，加水3-5mL溶解，加入碘片1.0g，全部溶解后，加水稀釋至300mL，置密閉棕色瓶中儲存。

藥品中大腸埃希菌檢查試驗操作規(guī)程

3.2.8營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉浸出粉3g，氯化鈉5g，水1000mL取上述成分，混合，微溫溶解后，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.2，滅菌。3.2.9營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備：牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g瓊脂15-17g蒸餾水1000mLpH7.4將除瓊脂以外的各成分溶解于水中，以1moL/LNaOH溶液校正pH7.4，分裝三角瓶，而后按培養(yǎng)基的量加入1.5%-1.7%瓊脂，0.1Mpa滅菌20min后倒平板備用。3.2.10膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）：蛋白胨20g，乳糖5g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀（K2HPO4）1g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）1.3g，牛膽鹽（或去氧膽酸鈉0.25g)1.3g，水1000mL,除乳糖、牛膽鹽外，取上述成分，混合，加熱溶解后，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為7.2±0.2，煮沸，濾清，加入乳糖、牛膽鹽，分裝，滅菌。藥品中大腸埃希菌檢查試驗操作規(guī)程

3.2.114—甲基傘形酮葡萄糖苷酸蛋白胨培養(yǎng)基（MUG）：蛋白胨10g，氯化鈣50mg，硫酸錳0.5mg，硫酸鋅0.5mg，硫酸鎂0.1g，氯化鈉10g，磷酸二氫鉀（無水KH2PO4）0.9g，磷酸氫二鈉（無水Na2HPO4），亞硫酸鈉40mg，去氧膽酸鈉1g，4—甲基傘形酮葡萄糖苷酸75mg，水1000mL除4—甲基傘形酮葡萄糖苷酸外，上述各成分溶解于1000mL水中，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為7.3±0.1，加入4—甲基傘形酮葡萄糖苷酸，溶解后，每管分裝5mL，115℃，滅菌20min。3.2.12曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基（EMB）：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基100mL，20%乳糖溶液5mL，曙紅鈉指示液2mL，亞甲藍指示液1.3—1.6mL取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，加熱溶化后，冷至60℃，按無菌操作加入滅菌的其它三種溶液，搖勻，傾注平皿。藥品中大腸埃希菌檢查試驗操作規(guī)程3.2.13曙紅鈉指示液：取曙紅鈉2.0g，加水溶解成100mL。3.2.14亞甲藍指示液：取亞甲藍0.5g，加水溶解成100mL。3.3對照用菌液的制備：取大腸埃希菌的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，接種至5mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置36℃±1℃，培養(yǎng)18～24h，取均勻培養(yǎng)物1mL用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每1mL含菌10~100cfu的菌懸液，其菌數(shù)在做對照試驗的同時用營養(yǎng)瓊脂注皿或平板涂布，經(jīng)培養(yǎng)后計數(shù)確定。3.4供試液的制備：取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液至1000mL，用勻漿儀（3000～5000r/min2～4min）或其他有效的方法，混勻，作為供試液。必要時加適量的無菌聚山梨酯80，并置水浴中適當加溫使供試品分散均勻。藥品中大腸埃希菌檢查試驗操作規(guī)程3.5陽性對照試驗

各供試品進行控制菌檢查時，應做陽性對照試驗。陽性對照試驗的加菌量為10-100cfu，供試品和增菌培養(yǎng)基用量及檢查按供試品的各控制菌檢查。陽性對照試驗應檢出相應的控制菌。已做驗證試驗的供試品，在該供試品檢查時不必再做陽性對照。3.6陰性對照試驗

取稀釋劑10ml加入100ml（或200ml）相應控制菌檢查用的增菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，應無菌生長。藥品中大腸埃希菌檢查試驗操作規(guī)程4.檢驗程序藥品中大腸埃希菌檢查試驗操作規(guī)程4.1增菌培養(yǎng)取膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基2份，每份各100ml。1份加入10ml供試液（相當于供試品1g、1ml、10cm2），另1份加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對照。培養(yǎng)18-24小時，必要時可延至48小時。陰性對照應無菌生長。取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5、24小時在366nm紫外光下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。在紫外光下若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)藍白色熒光，為MUG陽性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對照的MUG和靛基質(zhì)試驗應為陰性。如MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。藥品中大腸埃希菌檢查試驗操作規(guī)程4.2分離培養(yǎng)如呈現(xiàn)MUG陽性、靛基質(zhì)陰性或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性時，應將上述供試品BL增菌培養(yǎng)液輕輕搖動，以接種環(huán)沾取1-2環(huán)培養(yǎng)液劃線于;EMB或麥康凱瓊脂平板上，培養(yǎng)18-24h。若平板上無菌落生長、或生長的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。大腸埃希菌菌落形態(tài)特征藥品中大腸埃希菌檢查試驗操作規(guī)程培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍瓊脂呈紫黑色、淺紫色、藍紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，常有金屬光澤麥康凱瓊脂鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤當陽性對照的平板呈典型菌落生長時，若EMB或麥康凱瓊脂平板上生長的菌落與上表所列菌落形態(tài)特征相符或疑似者，應挑取可疑菌落進行分離、純化、染色鏡檢和IMViC試驗，確認大腸埃希菌。4.3純培養(yǎng)如EMB或麥康凱瓊脂平板上生長的菌落與上表所列特征相符或疑似者，以接種針輕輕接觸單個疑似菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應挑選2-3個以上疑似菌落，分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)18-24h，作以下檢查。如平板上無單個可疑菌落，但有可疑菌團（紫黑色，或有金屬光澤），應沾取可疑菌團培養(yǎng)物少許，或重新取增菌培養(yǎng)液分區(qū)劃線接種于EMB瓊脂平板，培養(yǎng)18-24h，再挑選單個疑似菌落，純培養(yǎng)，作以下檢查。藥品中大腸埃希菌檢查試驗操作規(guī)程4.4革蘭染色、鏡檢以接種環(huán)沾取無菌水于潔凈載玻片上，取上述疑似菌落的營養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，制成均勻涂片，自然或微溫干燥，再通過火焰2-3次（載玻片不燙手）固定。滴加結(jié)晶紫染液，染色1min，水洗。滴加碘液，媒染1min，水洗，以濾紙吸干余水。滴加95%乙醇，脫色20-30s，水洗。滴加沙黃染液，復染1min，待干后，鏡檢。染色結(jié)果判定：革蘭陽性菌呈藍紫色；革蘭陰性菌呈紅色。大腸埃希菌為革蘭陰性短桿菌，或球桿菌狀，亦有桿菌狀。藥品中大腸埃希菌檢查試驗操作規(guī)程5.注意事項5.1玻片必須潔凈，無劃痕。涂片的菌量宜少，菌不可濃。否則，菌細胞成堆或連成片。不利菌細胞染色反應判斷及形態(tài)觀察。5.2培養(yǎng)物的菌齡以16-24h為宜。培養(yǎng)時間過長，革蘭陽性菌易染成紅色。5.3脫色是關鍵。脫色時間不足，菌細胞易染成陽性；脫色時間過長，菌細胞易染成陰性。5.4可用已知革蘭染色為陽性、陰性的菌種做染色的質(zhì)量控制。藥品中大腸埃希菌檢查試驗操作規(guī)程項目九控制菌檢查及螨類檢查技術任務4藥品中大腸埃希菌檢查知識點4藥品中大腸埃希菌檢查方法4.1大腸埃希菌4.1.1大腸埃希菌即大腸桿菌為腸桿菌科埃希菌屬的模式種。大腸埃希菌是人和溫血動物腸道內(nèi)的棲居菌，隨糞便排出體外。在藥品中檢出大腸埃希菌表明該樣品受到人和溫血動物的糞便污染，即可能污染腸道病原體。大腸埃希菌可引起嬰幼兒、成人爆發(fā)性腹瀉。為保證人體健康，口服藥品必須檢查大腸埃希菌。4.1.2形態(tài)特征

大腸埃希菌為兩端鈍圓的短小直桿菌，革蘭染色陰性，無芽孢，多有鞭毛，以周身鞭毛運動或不運動。許多菌株有莢膜和微莢膜。4.1.3培養(yǎng)持征

大腸埃希菌最適培養(yǎng)溫度為37℃，可在15-46℃生長，最適pH是7.4-7.6，兼性厭氧。在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24h，形成菌膜，管底有黏液狀沉淀，培養(yǎng)物有糞臭味；在營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基中，可形成凸起、光滑、濕潤、乳白色、邊緣整開的菌落。藥品中大腸埃希菌檢查方法4.1.4生化反應

大腸埃希菌能迅速分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇等多種碳水化合物，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不分解尿素，靛基質(zhì)試驗陽性，甲基紅試驗陽性，VP試驗陰性，不利用拘酸鹽，不液化明膠4.1.5抵抗力

大腸埃希菌對理化因素的抵抗力，在無芽孢菌中是較強的一種，在室溫可存活數(shù)周，在土壤、水中存活數(shù)月，耐寒力強，能過冬。加熱60℃30min能被殺死。對漂白粉、酚、甲醛和戊二醛等均較敏感，水中含(0.5-1)/106氯能被殺死。大腸埃希菌對丁胺卡那及頭孢菌素類較敏感，對磺胺類、鏈霉素、氯霉素、金霉素、四環(huán)素等產(chǎn)生不同程度的耐藥性。藥品中大腸埃希菌檢查方法4.2檢查程序4.2.1增菌培養(yǎng)

取膽鹽乳糖培養(yǎng)基(BL)3瓶，每瓶各100ml。2瓶分別加入規(guī)定量的供試液，其中1瓶加入對照菌10-100個作陽性對照，第3瓶加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對照。于36℃±1℃培養(yǎng)18-24h，必要時可延至48h，陰性對照應無菌生長。4.2.2MUG-mdd快速檢查分別從上述增菌培養(yǎng)后的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中取0.2ml分別于裝有5mlMUG培養(yǎng)基的試管中36℃±1℃培養(yǎng)，于5、24h在366nm紫外光下觀察，同時，用未接種的MG培養(yǎng)基作本底對照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對照為MUC陰性和靛基質(zhì)陰性。如MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，判斷供試品未檢出大腸埃希菌。藥品中大腸埃希菌檢查方法4.2.3曙紅亞甲藍瓊脂或麥康凱瓊脂平板劃線分離如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性，均應在曙紅亞甲藍瓊脂(EMB)培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板劃線分離。分離如下：將增菌培養(yǎng)后的膽鹽乳糖培養(yǎng)液輕輕搖動，以接種環(huán)沾取1-2環(huán)培養(yǎng)液劃線于曙紅亞甲藍瓊脂(EMB)培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上,36℃±1℃分離培養(yǎng)18-24h，觀察菌落特征。大腸埃希菌菌落形態(tài)特征藥品中大腸埃希菌檢查方法培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲基藍(EMB)平板呈紫黑、淺紫色、藍紫色或，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，常有金屬光澤。麥康凱瓊脂(MacC)平板鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤。當陽性對照的平板呈典型菌落生長時，如EMB或麥康凱瓊脂平板上生長的菌落與大腸埃希菌菌落不符，報告未檢出大腸埃希菌。如有疑似大腸埃希菌的菌落則進行分離、純化、染色鏡檢和IMViC試驗，確認是否為大腸埃希菌。4.2.4純培養(yǎng)

選擇平板菌落典型特征相符或疑似菌的2～3個菌落，分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)18～24h，后取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面的培養(yǎng)物進行檢查。4.2.5革蘭染色鏡檢以接種環(huán)沾取無菌水于潔凈載玻片上，取上述可疑菌落的營養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，制成均勻涂片，通過火焰2～3次干燥固定。初染：滴加結(jié)晶紫染液，染色1min，水洗。媒染：滴加碘液，媒染1min，水洗。脫色：滴加95%乙醇，脫色20-30s，至流出液無色，水洗。藥品中大腸埃希菌檢查方法復染：滴加沙黃染液，復染1min，水洗，待干后，鏡檢。革蘭陽性菌呈藍紫色，革蘭陰性菌呈紅色。大腸埃希菌為革蘭陰性短桿菌，或球桿菌狀，亦有桿菌狀。4.2.6生化試驗4.2.6.1靚基質(zhì)試驗(1)將純培養(yǎng)物接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24～48h，沿管壁加入對甲氨基苯甲醛試液0.3～0.6m，觀察液面是否有紅色環(huán)。大腸埃希菌應有紅色環(huán)，液面有紅色環(huán)為陽性。4.2.6.2甲基紅試驗(M)將純培養(yǎng)物接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24～48h，加甲基紅指示劑數(shù)滴，觀察結(jié)果，紅色為陽性，黃色為陰性。大腸埃希菌應是陽性。藥品中大腸埃希菌檢查方法4.2.6.3乙酰甲基甲醇生成試驗（VP）將純培養(yǎng)物接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24～48h，加入VP試劑甲液1ml，混勻，再加入VP試劑乙液0.4ml，充分搖勻，觀察結(jié)果，數(shù)分鐘后出現(xiàn)紅色為陽性，黃色為陰性；大腸埃希菌應是陰性。4.2.6.4枸櫞酸鹽利用試驗(C)將純培養(yǎng)物接種于枸櫞酸鹽瓊脂培養(yǎng)基中,37℃養(yǎng)24～48h。觀察結(jié)果，培養(yǎng)基由綠色變成藍色為陽性，黃色為陰性。大腸埃希菌應是陰性。最后