實驗17組織總RNA提取1實驗171目的1．了解某一特定組織或細(xì)胞某一特定mRNA轉(zhuǎn)錄量的變化，如RT-PCR、Northernblot等。2．了解某一特定組織或細(xì)胞全部mRNA轉(zhuǎn)錄量的變化，如DD-PCR、基因芯片等。3．獲得某一特定組織或細(xì)胞全部mRNA，以便建立cDNA庫等。4．獲得某一特定組織或細(xì)胞全部RNA。以上工作的前提是制備純凈且完整的RNA。2目的2現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，人類的絕大多數(shù)疾病都是由若干基因表達(dá)的改變所引起的。根據(jù)生物學(xué)“中心法則”原理，基因的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄與翻譯兩個階段。其中，由DNA到RNA的轉(zhuǎn)錄過程受到各種因素的調(diào)節(jié)，其調(diào)節(jié)水平反映出某種或某些特定的因素對相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)能力。已有的研究一再表明，中醫(yī)藥所發(fā)揮的治療與預(yù)防作用是直接或間接調(diào)整了基因的轉(zhuǎn)錄而實現(xiàn)的。RNA主要由rRNA（占總量的80～85％），tRNA和核內(nèi)小分子RNA（占總量的10～15％）以及mRNA（占總量的1～5％）所構(gòu)成。理論上認(rèn)為每克組織（或108個培養(yǎng)細(xì)胞）可提取5～10mgRNA。3現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，人類的絕大多數(shù)疾病都是由若干基因表達(dá)的改變提取總RNA的方法有多種，比如：（1）本實驗介紹的方法，采用Trizol試劑，或類似的方法，稱為一步法，方便而快捷。缺點是RNA的獲得量偏低，質(zhì)量不夠純凈。（2）超離心方法，可以獲得豐富且質(zhì)量高的RNA。缺點是實驗時間比較長，要求離心過夜。（3）其它一些試劑盒，主要是利用某些特定的介質(zhì)吸附RNA，洗去其它雜質(zhì)，最后洗脫純凈的RNA?？梢栽诙虝r間內(nèi)獲得純凈的RNA。但是價格比較昂貴。4提取總RNA的方法有多種，比如：4原理本實驗類似于“異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法”。方法采用強(qiáng)RNA酶抑制劑異硫氰酸胍，抑制RNA酶的活性，防止RNA降解；酚/氯仿使蛋白質(zhì)變性。離心后，RNA選擇性地進(jìn)入無DNA和蛋白質(zhì)的水相。之后通過異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌等，便可得到較為完整與純潔的總RNA。5原理5實驗準(zhǔn)備

6實驗準(zhǔn)備677實驗步驟——參照GIBCOBRC公司有Trizol試劑盒。1．引頸處死小鼠，剖腹切取肝臟組織50mg（或106-107個細(xì)胞），加入1mlTrizol液，剪碎，快速勻漿。2．22℃，靜置5min。3．加入氯仿0.2ml，顛倒15s。4．22℃，靜置3min。5．離心：4℃×15000轉(zhuǎn)/分×15min。6．取上清液0.45ml。7．加入0.45ml異丙醇，混勻。8實驗步驟88．22℃，靜置10min。9．離心：4℃×15000轉(zhuǎn)/分×10min。10．棄上液。11．加入1ml4℃75%乙醇。12．離心：4℃×10000轉(zhuǎn)/分×5min。13．棄上液，真空干燥5min。14．用高壓消毒過的去離子水25ul水冰上溶解，-70℃保存。15．紫外分光光度計測定RNA的含量：98．22℃，靜置10min。9取樣本5ul加入石英比色杯內(nèi)，加入蒸水1ml，充分混勻。與蒸水對照。讀260nm、280nm兩個測得值，記錄。計算：OD260為1時，為40ugRNA，所以計算如下：樣本RNA含量（ug/ul）=OD260×200×40/1000當(dāng)OD值260/280<1.8時，提示有蛋白或酚的污染。10取樣本5ul加入石英比色杯內(nèi)，加入蒸水1ml，充分混勻?qū)嶒灲Y(jié)果得到比較純凈的肝組織總RNA。據(jù)參考文獻(xiàn)，分光光度計讀數(shù)260/280值為1.85±0.04。11實驗結(jié)果11注意事項1．實驗過程中要求創(chuàng)造一個無RNA酶污染的環(huán)境。主要包括兩個方面的工作：其一，極力避免來源于操作者的手及實驗的器皿和試劑等外源性RNA酶的污染；其二，盡力抑制組織細(xì)胞中內(nèi)源性RNA酶的活力，并盡可能地去除。12注意事項122．由于RNA酶到處存在，不易失活，極易造成污染而導(dǎo)致RNA的降解，造成實驗失敗。因此建議所有用品均應(yīng)嚴(yán)格按要求消毒，注明RNA專用。嚴(yán)格按無菌操作要求操作。通常用于RNA抽提與保存的塑料制品用DEPC水室溫下浸泡過夜，再高壓消毒。注意，DEPC處理的水和容器，必須高溫滅活DEPC，以免其日后抑制其它酶的活性，導(dǎo)致實驗失敗。玻璃制品泡酸反復(fù)沖洗后，250℃干烤3小時以上。132．由于RNA酶到處存在，不易失活，極易造成污染而導(dǎo)致3．去除內(nèi)源性RNA酶的方法可用酚/氯仿反復(fù)抽提幾次，直至中間的蛋白層基本消失。我們的經(jīng)驗是至少抽提3次以上。4．實驗過程中應(yīng)將組織充分勻漿，一般可先將組織塊用剪刀剪碎，以利于快速勻漿。5．在酚/氯仿抽提過程中，一定要顛倒混勻充分，這樣才能使蛋白質(zhì)充分變性，才能充分去除蛋白質(zhì)與RNA酶。為了提高RNA的純度，該步驟可以重復(fù)若干次。143．去除內(nèi)源性RNA酶的方法可用酚/氯仿反復(fù)抽提幾次，直6．抽提過程中，由于異硫氰酸胍是RNA酶的強(qiáng)抑制劑，在整個實驗過程中不會產(chǎn)生RNA的降解。但在加入75%乙醇洗滌時，以及RNA干燥和加水溶解時須防止RNA酶的污染。7．在吸取上清時，切不可將上清與酚交界處的蛋白及下面的酚吸起，造成RNA的污染。因此，通常輕輕吸取上清，且留有部分上清，以免攪起緊鄰著的酚。156．抽提過程中，由于異硫氰酸胍是RNA酶的強(qiáng)抑制劑，在整8．若需抽提大量RNA時，以上試劑、試管可按比例放大。所獲RNA建議分裝，以免使用過程中反復(fù)凍融。9．如果是培養(yǎng)細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液后，直接加Trizol溶液裂解細(xì)胞，后面的實驗過程一致。10．如果RNA降解難以控制，可以選擇采用RNAguard。168．若需抽提大量RNA時，以上試劑、試管可按比例放大。所例：胰腺組織RNA的降解與控制：編號樣品說明5大鼠胰腺組織TRIZOL直接勻漿。6大鼠胰腺組織TRIZOL中泡3