葉盤法的原理及影響因素先看一道試題：科學(xué)家利用葉盤法將葡萄的相關(guān)基因?qū)敕?，得到早熟番茄。葉盤法的具體做法是：先將實(shí)驗(yàn)材料的葉子表面進(jìn)行消毒，再用消毒過的打孔器從葉子上取下圓形小片，即葉盤。將它放在土壤農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中浸泡4～5min，然后用濾紙吸干，放在特殊培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩天后，轉(zhuǎn)移到含有適當(dāng)抗生素的選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。數(shù)周后，葉盤周圍會長出愈傷組織并分化成幼苗。請回答：（1）科學(xué)家培養(yǎng)早熟番茄應(yīng)用了基因工程技術(shù)，該技術(shù)的原理是

，科學(xué)家利用葉盤法時(shí)屬于基因工程的第三步，即

。（2）農(nóng)桿菌通常感染

植物和裸子植物，是因?yàn)檫@些植物在傷口處的細(xì)胞會分泌大量的

化合物，吸引農(nóng)桿菌。農(nóng)桿菌能夠介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的原因是：

。（3）愈傷組織經(jīng)后續(xù)處理可以得到早熟番茄幼苗，這是因?yàn)橛鷤M織細(xì)胞中含有

和

。答案：（1）基因重組

將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（2）雙子葉

酚類

含有的Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上（3）番茄全套的遺傳物質(zhì)

葡萄相關(guān)基因解析：（1）基因工程技術(shù)的原理是基因重組。葉盤法是將葡萄的相關(guān)基因?qū)敕?，是基因工程的第三步，即將目的因?qū)胧荏w細(xì)胞。（2）農(nóng)桿菌通常感染雙子葉植物和裸子植物，是因?yàn)檫@些植物在傷口處的細(xì)胞會分泌大量的酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌。農(nóng)桿菌能夠介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的原因是含有的Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。（3）愈傷組織經(jīng)后續(xù)處理可以得到早熟番茄幼笛，這是因?yàn)橛鷤M織細(xì)胞中含有番茄全套的遺傳物質(zhì)和葡萄相關(guān)基因。植物細(xì)胞利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化常用的方法稱為葉盤法。葉盤法實(shí)際上是對共培養(yǎng)法加以改進(jìn)后而創(chuàng)立的一種轉(zhuǎn)化方法。那么，其原理是什么？影響因素有哪些？葉盤法的步驟：先將實(shí)驗(yàn)材料(如煙草)的葉子表面進(jìn)行消毒，再用消毒過的不銹鋼打孔器從葉子上取下圓形小片，即葉盤。在超凈工作臺上，為了對葉盤進(jìn)行接種處理，需將它放在土壤農(nóng)癌桿菌培養(yǎng)液中浸泡4－5min，然后用濾紙吸干，放在看護(hù)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，注意需將葉子背面接觸培養(yǎng)基。所謂看護(hù)培養(yǎng)基，是特定的固體培養(yǎng)基上均勻分布一層胡蘿卜細(xì)胞或其他細(xì)胞的懸浮液，然后覆蓋一層濾紙即成。葉盤在看護(hù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩天后，轉(zhuǎn)移到含有適當(dāng)抗生素的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。將經(jīng)過共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)移到加有選擇壓的脫菌分化和愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。在光照的條件下，25℃進(jìn)行選擇培養(yǎng)。選擇培養(yǎng)2－3周后，外植體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞將分化出抗性不定芽，或者產(chǎn)生抗性愈傷組織。將這些抗性材料轉(zhuǎn)移到相應(yīng)繼代選擇培養(yǎng)基上，或者轉(zhuǎn)入附加選擇壓的生長和分化培養(yǎng)基中，令其生長和誘導(dǎo)分化。待不定芽長到1cm以上時(shí)，切下并插入含有選擇壓的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行根培養(yǎng)，兩周左右長出不定根。最后分化出幼苗。對這些幼苗的進(jìn)一步檢測(如用Southern印跡法、Northern印跡法、免疫分析法等)可以確定它們是否含外源基因以及外源基因的表達(dá)情況。葉盤法的機(jī)理：葉盤法實(shí)際上是對共培養(yǎng)法加以改進(jìn)后而創(chuàng)立的一種轉(zhuǎn)化方法。用農(nóng)桿菌感染葉片外植體并短期共培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，農(nóng)桿菌的vir基因被誘導(dǎo)，它的活化可以啟動T-DNA向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。共培養(yǎng)后，也要進(jìn)行轉(zhuǎn)化的外植體的篩選、愈傷組織的培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化等步驟，以得到再生植株（如圖）。葉盤法的優(yōu)點(diǎn)和影響因素：葉盤法由于不需進(jìn)行原生質(zhì)體操作等，方法簡單，獲得轉(zhuǎn)化植株也更快，是用植物外植體為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的一個(gè)良好途徑。影響遺傳轉(zhuǎn)化因素也有很多，如植物基因型，農(nóng)桿菌類型，外源基因的選擇、預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)時(shí)間等。例、葉盤轉(zhuǎn)化法是Horsch等人于1985年發(fā)展起來的一種轉(zhuǎn)化法，以培育轉(zhuǎn)基因耐鹽毛白楊為例，操作程序是先將毛白楊葉子表面進(jìn)行消毒，再用消毒過的打孔器從葉子上取下圓形小片，即葉盤。然后進(jìn)行下列操作，請回答:（1）毛白楊葉盤與重組農(nóng)桿菌共培養(yǎng)以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化：農(nóng)桿菌能夠介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的原因是

。（2）脫分化和篩選培養(yǎng)：葉盤接種在含卡那霉素的培養(yǎng)基上,卡那霉素的作用是

，作為運(yùn)載體的Ti質(zhì)粒應(yīng)含有

基因，運(yùn)載體上的

是RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點(diǎn)。（3）獲得抗性植株：葉盤周圍長出愈傷組織后分別轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)“生芽”和“生根”的培養(yǎng)基中，此過程培養(yǎng)基中加入的植物激素主要是

。（4）耐鹽基因的檢測與鑒定:①分子水平：可采用

的方法來檢測轉(zhuǎn)基因毛白楊提取液中有無相應(yīng)的耐鹽蛋白。②個(gè)體水平:請?jiān)O(shè)計(jì)個(gè)體水平檢測方案

。答案:（1）含有的Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)