第四章

核酸化學(xué)NucleicAcidchemistry第1頁第一節(jié)概述第二節(jié)核酸化學(xué)組成第三節(jié)核酸分子構(gòu)造第四節(jié)核酸性質(zhì)第五節(jié)核酸研究辦法本章內(nèi)容第2頁第一節(jié)概述

核酸（nucleicacid—NA）是一類主要生物大分子，擔(dān)負(fù)著生命信息儲存與傳遞。核酸是當(dāng)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)主要研究領(lǐng)域，是基因工程操作關(guān)鍵分子。第3頁1868

F.

Miescher從膿細(xì)胞細(xì)胞核中分離出了一種含磷酸有機物，當(dāng)初稱為核素（nuclein）,后稱為核酸（nucleicacid）。1944

Avery

等通過肺炎球菌轉(zhuǎn)化試驗證明DNA是遺傳物質(zhì)。1952Hershey,Chase-噬菌體標(biāo)識試驗。1953

Watson和Crick提出DNA構(gòu)造雙螺旋模型。1958

Crick提出遺傳信息傳遞中心法則。1973Boyer，Cohen-DNACloning(克隆）。1976DNASequencing(序列分析）。1990HumanGenomeProject（人類基因組計劃）。一、核酸研究歷史第4頁光滑型細(xì)胞（有毒）粗糙型細(xì)胞（無毒）破碎細(xì)胞DNAase降解后DNA粗糙型細(xì)胞接收光滑型DNA只有粗糙型大多數(shù)仍為粗糙型少數(shù)光滑型細(xì)胞被轉(zhuǎn)化SSRRR+DNA1944年Avery細(xì)菌轉(zhuǎn)化試驗第5頁肺炎球菌（pneumococcus）1928年細(xì)菌學(xué)家Griffith細(xì)菌毒性試驗第6頁噬菌體感染試驗1952年美國Hershey噬菌體感染試驗第7頁第8頁

真核生物

原核生物細(xì)胞核（98%）擬核線粒體mDNA

（少許）質(zhì)粒DNA（plasmid）葉綠體ctDNA

（少許）等病毒DNA

細(xì)胞質(zhì)（90%）細(xì)胞質(zhì)核仁（少許）病毒RNA

二、核酸種類和分布DNA脫氧核糖核酸RNA核糖核酸注：生物細(xì)胞都具有DNA和RNA；病毒中只含DNA或只含RNA。第9頁第二節(jié)核酸化學(xué)組成

核酸是由幾十個甚至幾千萬個核苷酸聚合而成具有一定空間構(gòu)造生物大分子。

基本元素：C、H、O、N、P；其中P含量比較穩(wěn)定，占9%-10%，通過測定P含量來推算核酸含量（定磷法）。第10頁磷酸核苷堿基

戊糖

核酸→核苷酸

第11頁一、戊糖

組成核酸戊糖有兩種。DNA所含糖為β-D-2-脫氧核糖；RNA所含糖則為β-D-核糖。第12頁二、堿基1.嘌呤（Purine）

腺嘌呤AdenineA

鳥嘌呤guanineG第13頁2.嘧啶（Pyrimidine）胸腺嘧啶T胞嘧啶C尿嘧啶U第14頁

核酸中也存在某些不常見稀有堿基。稀有堿基種類很多，大部分是上述堿基甲基化產(chǎn)物。二氫尿嘧啶（DHU）第15頁修飾堿基簡寫符號

(為1時能夠不寫)第16頁三、核苷（nucleoside）核苷：戊糖+堿基

糖與堿基之間C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵核苷中戊糖與堿基連接方式：1’2’3’4’5’(OH)1’2’3’4’5’(OH)第17頁修飾核苷/稀有核苷修飾核苷包括三種情況:

（1）由修飾堿基和糖組成核苷（2）由非修飾堿基和2'-O-甲基核糖組成核苷（3）由堿基與糖連接方式特殊核苷

第18頁（1）（2）二氫尿嘧啶核苷

(Am)第19頁（3）(ψ)第20頁取代基用下列小寫英文字母表達(dá):甲基m乙?；鵤c氨基n甲硫基ms羥基o或h硫基s異戊烯基i羧基c第21頁例：第22頁四、核苷酸（nucleotide）

核苷酸：核苷+磷酸

戊糖+堿基+磷酸

H第23頁五、游離核苷酸及其衍生物形式1.繼續(xù)磷酸化第24頁2.環(huán)化磷酸化

cAMP

cGMP第25頁3.輔酶

NAD、NADP、FAD、HSCoA

FADNAD、NADPHSCoA第26頁4.GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白

生物合成和多糖生物合成活性糖

基供體。

第27頁第三節(jié)核酸分子構(gòu)造一、DNA構(gòu)造一級構(gòu)造:DNA核苷酸鏈中脫氧核苷酸組成和排列次序。二級構(gòu)造：DNA兩條多聚鏈間通過氫鍵形成雙螺旋構(gòu)造。三級構(gòu)造：DNA雙鏈深入折疊卷曲形成構(gòu)象。第28頁（一）DNA一級構(gòu)造

由dAMP、dGMP、dCMP、dTMP核苷酸單體通過3’,5’-磷酸二酯鍵相連而成鏈狀聚合物。5’5’3’3’第29頁構(gòu)造式5′-磷酸端（常用5′-P表達(dá)）；3′-羥基端（常用3′-OH表達(dá)）核苷酸鏈具有方向性，當(dāng)表達(dá)一種核苷酸鏈時，必須注明它方向是5′→3′或是3′→5′。第30頁字母式5′PAPCPGPCPTPGPTPAOH3′

5′PACGCTGTAOH3′線條式OH第31頁DNA一級構(gòu)造也可指DNA分子中堿基次序。DNA堿基次序本身就是遺傳信息存放分子形式。生物界物種多樣性即寓于DNA分子中四種核苷酸千變?nèi)f化不一樣排列組合之中。第32頁（二）DNA二級構(gòu)造Watson和Crick于1953年提出了DNA雙螺旋構(gòu)造模型，說明了DNA二級構(gòu)造。（即B型DNA）第33頁（1）Chargaff定則

（1950s,E.Chargaff發(fā)覺）DNA堿基組成符合：A=T；G=C；

A+G=T+C。不對稱比率：A+T/G+C；物種不一樣，DNA堿基組成不一樣；物種親緣愈接近，堿基組成也愈接近，該比率越相近似。Ⅲ.具有種特異性，沒有器官和組織特異性，年紀(jì)、營養(yǎng)情況、環(huán)境變化不影響DNA堿基組成。1．提出DNA雙螺旋構(gòu)造模型根據(jù)

第34頁第35頁（2）x-光衍射分析20世紀(jì)40年代Astbury1952年M.Wilkins第36頁2．DNA雙螺旋構(gòu)造模型（double-helicalstructure）1953年Watson和Crick提出了DNA雙螺旋構(gòu)造。第37頁DNA雙螺旋構(gòu)造模型重點（1）螺旋中兩條鏈反向平行，即其中一條鏈方向為5′→3′，而另一條鏈方向為3′→5′，兩條鏈共同圍繞一種假想中心軸呈右手雙螺旋構(gòu)造。第38頁DNA雙螺旋構(gòu)造模型重點（2）疏水堿基位于雙螺旋內(nèi)側(cè)，親水磷酸和脫氧核糖基位于螺旋外側(cè)。堿基平面與螺旋軸垂直，脫氧核糖平面與中心軸平行。由于幾何形狀限制，堿基對只能由嘌呤和嘧啶配對，即A與T，G與C。這種配對關(guān)系，稱為堿基互補。A和T之間形成兩個氫鍵，G與C之間形成三個氫鍵。第39頁T-A堿基對C-G堿基對第40頁DNA雙螺旋構(gòu)造模型重點（3）由于堿基對排列方向性，使得堿基對占據(jù)空間是不對稱，因此，在雙螺旋表面形成大小兩個凹槽，分別稱為大溝和小溝，二者交替出現(xiàn)。2.0nm小溝大溝第41頁DNA雙螺旋構(gòu)造模型重點（4）雙螺旋橫截面直徑約為2nm，相鄰兩個堿基平面之間距離（軸距）為0.34nm，每10個核苷酸形成一種螺旋，其螺距（即螺旋旋轉(zhuǎn)一圈）高度）為3.4nm。2.0nm小溝大溝第42頁DNA雙螺旋構(gòu)造模型重點（5）兩條鏈借堿基之間氫鍵和堿基堆積力（即堿基之間范德華力）牢靠連接起來，維持DNA雙螺旋三維構(gòu)造。兩條鏈?zhǔn)菈A基互補關(guān)系。第43頁3.DNA雙螺旋構(gòu)造穩(wěn)定原因

氫鍵

堿基堆積力

磷酸基上負(fù)電荷被胞內(nèi)組蛋白或正離子中和

堿基處于疏水環(huán)境中第44頁4.DNA雙螺旋構(gòu)造意義

該模型揭示了DNA作為遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性特性，最有價值是確認(rèn)了堿基配對標(biāo)準(zhǔn)，這是DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄分子基礎(chǔ)，亦是遺傳信息傳遞和體現(xiàn)分子基礎(chǔ)。該模型提出是上個世紀(jì)生命科學(xué)重大突破之一，它奠定了生物化學(xué)和分子生物學(xué)乃至整個生命科學(xué)飛速發(fā)展基石。第45頁DNA雙螺旋構(gòu)象類型第46頁（三）DNA三級構(gòu)造---超螺旋1）超螺旋是指雙螺旋進(jìn)一步扭曲或再螺旋構(gòu)象。2）正超螺旋（變緊，過旋）和負(fù)超螺旋（變松，欠旋）。3）人類46條染色體DNA總長可達(dá)1.7m，通過螺旋化壓縮，實際總長只有200nm。第47頁負(fù)超螺旋第48頁核小體盤繞及染色質(zhì)示意圖第49頁DNA存在形式--核小體真核生物中DNA雙螺旋沿著組蛋白八聚體關(guān)鍵短軸繞1.75圈，形成左手超螺旋，稱核小體。染色質(zhì)基本構(gòu)造單位是核小體。串珠狀構(gòu)造深入卷曲形成螺線管，后者再深入卷曲形成超螺旋管，形成染色單體。第50頁基因和基因組基因即一段有功能DNA片段，生物細(xì)胞中DNA分子最小功能單位（交換單位）。一種細(xì)胞或生物體所含全套基因稱基因組。第51頁二、RNA分子構(gòu)造（一）RNA分類及特點（二）

RNA分子構(gòu)造特點

第52頁（一）RNA特點及分類構(gòu)造特點：1.堿基組成：A、G、C、U（A＝U/G≡C）；2.稀有堿基較多，穩(wěn)定性較差，易水解；3.多為單鏈構(gòu)造，少數(shù)局部形成螺旋（發(fā)夾構(gòu)造）；4.分子較小。分類：1.信使RNA（mRNA）2.轉(zhuǎn)運RNA（tRNA）3.核糖體RNA（rRNA）第53頁MessengerRNA約占總RNA3%-5%，含量最少，種類最多。成熟mRNA不含內(nèi)含子，hnRNA具有。mRNA從DNA轉(zhuǎn)錄遺傳信息，并作為蛋白質(zhì)合成模板，決定蛋白質(zhì)氨基酸次序。第54頁RibosomeRNA

約占所有RNA80%，含量最多。與多種蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖體，后者是合成蛋白質(zhì)場所。第55頁原核生物真核生物核糖體rRNA核糖體rRNA

30s70s

50s16s5s、23s40s80s50s18s5s、5.8s、28s第56頁TransferRNA約占總RNA10-15%，分子最小。它在蛋白質(zhì)生物合成中起翻譯mRNA信息，并將對應(yīng)氨基酸轉(zhuǎn)運到核糖體，參與蛋白質(zhì)體合成。已知每一種氨基酸最少有一種對應(yīng)tRNA。第57頁（二）RNA分子構(gòu)造特點tRNA構(gòu)造第58頁二級構(gòu)造特性：單鏈三葉草葉形四臂四環(huán)三級構(gòu)造特性：在二級構(gòu)造基礎(chǔ)上深入折疊扭曲形成倒L型第59頁酵母tRNAAla

二級構(gòu)造

DHU環(huán)IGC反密碼子反密碼環(huán)氨基酸臂可變環(huán)TψC環(huán)CCAAla3′5′第60頁2）rRNA分子構(gòu)造特性：

單鏈，螺旋化程度較tRNA低

與蛋白質(zhì)組成核糖體后方能發(fā)揮其功能5SRNA二級構(gòu)造第61頁3）mRNA分子構(gòu)造在轉(zhuǎn)錄一章講授第62頁第四節(jié)核酸性質(zhì)一、一般物理性質(zhì)二、核酸水解三、兩性解離四、紫外吸取性質(zhì)五、穩(wěn)定性六、變性七、復(fù)性與雜交第63頁一、一般物理性質(zhì)1.DNA白色纖維狀固體，RNA白色粉末狀固體，都微溶于水，不溶于乙醇，因此常用乙醇來沉淀DNA；DNA溶液黏度大于RNA。2.DNA難溶于0.14mol/LNaCl溶液，可溶于

1—2mol/LNaCl溶液，RNA則相反，可據(jù)此分離二者。3.加熱條件下，

D－核糖＋濃鹽酸＋苔黑酚綠色

D－2－脫氧核糖＋酸＋二苯胺藍(lán)紫色第64頁二、核酸水解核酸分子中磷酸二酯鍵可在酸或堿性條件下水解切斷。DNA和RNA對酸或堿耐受程度有很大差異。室溫條件下，DNA在堿中變性，但不水解，RNA水解。在細(xì)胞內(nèi)核酸分子受DNA酶作用。第65頁三、兩性解離核酸含酸性磷酸基團，又含弱堿性堿基，為兩性電解質(zhì)，可發(fā)生兩性解離；核酸相稱于多元酸，pH大于4時，呈陰離子狀態(tài)；等電點第66頁四、紫外吸取在核酸分子中嘌呤堿和嘧啶堿都具有共軛雙鍵體系，在260nm有吸取；能夠作為區(qū)分蛋白質(zhì)和對核酸及其組份定性和定量測定根據(jù)，進(jìn)行核酸純度判定，也可作為核酸變性和復(fù)性指標(biāo)。第67頁DNA紫外吸取光譜天然DNA變性DNA核苷酸總吸取值1232202402602800.10.20.30.4波長（nm）光吸取123第68頁根據(jù)A260/A280比值判斷核酸樣品純度純DNA：A260/A280=1.8純RNA：A260/A280=2.0（若樣品中具有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值顯著減少）純核酸樣品可根據(jù)260nm光吸取值算出其含量若260nm光吸取值為1相稱于50μg/ml雙螺旋DNA或相稱于40μg/ml單鏈DNA或RNA或相稱于20μg/ml寡核苷酸。第69頁五、DNA穩(wěn)定性1.DNA溶液呈粘稠狀，但事實上DNA雙螺旋構(gòu)造僵直而有剛性，易斷成碎片，這也是目前難以取得完整大分子DNA原因。2.溶液狀態(tài)DNA易受DNA酶作用而降解，抽干水分DNA性質(zhì)十分穩(wěn)定。第70頁六、DNA變性1.概念2.變性條件3.變性特性第71頁1.概念是指核酸雙螺旋區(qū)多聚核苷酸鏈間氫鍵斷裂，變成單鏈構(gòu)造過程。第72頁2.DNA變性條件能夠引發(fā)核酸變性原因有：1）溫度升高；2）酸堿度變化、pH（>11.3或<5.0）；3）有機溶劑如甲醛和尿素、甲酰胺等；4）低離子強度。第73頁3.DNA變性特性變性核酸將失去其部分或所有生物活性。變性變化了DNA二級構(gòu)造。核酸變性并不包括磷酸二酯鍵斷裂，因此它一級構(gòu)造(堿基次序)保持不變。DNA變性過程是突變性，它在很窄溫度區(qū)間內(nèi)完成。DNA解鏈溫度紫外吸取值顯著增加，即增色效應(yīng)。粘度減少，沉降系數(shù)增加。第74頁DNA解鏈溫度（熔點，Tm

）當(dāng)50%DNA變性時溫度稱為該DNA解鏈溫度，即增色效應(yīng)達(dá)成二分之一時溫度；一般DNATm值在70-85

C之間。均一DNA（如病毒）Tm值范圍較小。分子中G和C含量越高，越不易變性，Tm值越高。可通過經(jīng)驗公式計算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44Tm值隨溶液鹽濃度增加而增大，

Tm值較低，易變性，不易保存。第75頁溶解曲線與Tm。。第76頁影響Tm值原因

①DNA均一性

②DNA中G-C對含量

經(jīng)驗式:(G-C)%=(Tm-69.3)×2.44③鹽離子強度第77頁增色效應(yīng)與減色效應(yīng)

天然DNA分子在熱變性條件下，雙螺旋構(gòu)造破壞，堿基暴露，在紫外光260nm波長處吸取度顯著增加，此現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。變性DNA分子復(fù)性形成雙螺旋構(gòu)造時其紫外吸取減少現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)。第78頁第79頁七、DNA復(fù)性概念復(fù)性條件3.影響復(fù)性原因4.復(fù)性動力學(xué)5.分子雜交第80頁1.概念1.變性DNA在合適條件下，兩條彼此分開單鏈能夠重新締合成為雙螺旋構(gòu)造，其物理性質(zhì)和生物活性隨之恢復(fù)，這一過程稱為復(fù)性；2.對于熱變性DNA，在遲緩冷卻條件下可重新結(jié)合恢復(fù)雙螺旋構(gòu)造，稱為退火。3.DNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，不過生物活性一般只能得到部分恢復(fù)。第81頁DNA復(fù)性圖示第82頁2.DNA復(fù)性條件1.將熱變性DNA驟然冷卻至低溫時，DNA不也許復(fù)性。即淬火。2.將變性DNA遲緩冷卻時，能夠復(fù)性。退火溫度＝Tm－25℃3.分子量越大復(fù)性越難。濃度越大，復(fù)性越容易。另外，DNA復(fù)性需要一定鹽濃度，也與它本身組成和構(gòu)造有關(guān)。第83頁高于Tm值5℃

復(fù)性也稱退火

第84頁3.影響復(fù)性原因

①樣品性質(zhì)

②DNA濃度

③DNA片段大小

④溫度

⑤離子強度

第85頁4.復(fù)性動力學(xué)

DNA復(fù)性過程是一種雙分子反應(yīng)S：singlestrandDNA

D：doublestrandDNA

第86頁Cot:時Cot值，即指復(fù)性完成二分之一時Cot值。第87頁5.分子雜交1.在變性DNA溶液中加入外源DNA單鏈分子或RNA單鏈分子（與原DNA具有同源性），去掉變性條件后復(fù)性形成雙螺旋構(gòu)造過程。2.這樣形成新分子稱為雜交DNA分子。3.利用核酸雜交可檢測特定核苷酸片段或研究同源性等。第88頁分子雜交

探針：用于雜交異源DNA或RNA序列，其核苷酸序列是人工特定、已知，經(jīng)放射性標(biāo)識一條鏈。第89頁核酸變性、復(fù)性和雜交變性（加熱）探針雜交（遲緩冷卻）復(fù)性（遲緩冷卻）第90頁分子雜交種類SouthernBlot：DNA-DNA雜交NorthernBlot：DNA-RNA雜交WesternBlot：抗原-抗體進(jìn)行雜交原位雜交：活體組織上進(jìn)行雜交，顯出熒光第91頁Southern印跡法DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上與放射性標(biāo)識DNA探針雜交放射自顯影帶有DNA片段凝膠凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段膜第92頁第五節(jié)核酸研究辦法

一、核酸分離、提取通則

為了得到完整大分子核酸，一般要注意3點：1．保持低溫（0o～4℃）。2．避免過酸、過堿，避免劇烈攪拌。3．避免核酸酶作用。

第93頁抑制DNase：

可加檸檬酸鈉、EDTA等金屬螯合劑；或加去污劑十二烷基硫酸鈉