海藻酸鈉固定化-葡萄糖醛酸苷酶工藝研究

目前，甘草次酸（gl）的生物法已轉(zhuǎn)化為高生物活性物質(zhì)，并已成為國際食品和醫(yī)療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。作為功能性甜味劑,與甘草中主要的有效成分甘草酸(Glycyrrhizin,GL)GL相比,GAMG具有高甜度低熱量的特點(diǎn),其甜度是GL的5倍多,是蔗糖的1000多倍;在醫(yī)藥功效方面,與GL和甘草次酸(Glycyrrhetinicacid,GA)相比,GAMG在體液中具有更好的溶解度和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力,藥物作用起效更快,并且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,GAMG的LD本課題組前期從新疆甘草主產(chǎn)區(qū)不同生態(tài)條件下的土壤中分離篩選出的一株真菌Penicilliumsp.Li-3,由該真菌表達(dá)的β-葡萄糖醛酸苷酶能定向催化GL生成GAMG,轉(zhuǎn)化率高達(dá)88.4%1材料和方法1.1材料和機(jī)器1.1.1a土壤基因型nPenicilliumsp.Li-3(課題組前期從土壤中篩選得到)基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基:每升水中含甘草酸單銨鹽2g,NaNO海藻酸鈉:化學(xué)純CP,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;其他試劑和藥品均為國產(chǎn)分析純。1.1.2主要設(shè)備紫外-可見分光光度計(jì)(澳大利亞GBC公司);電腦恒流泵(DHL-A上海青浦滬西儀器廠)1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1粗酶液的制備250mL三角瓶裝有80mL初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基,接種于30℃恒溫振蕩(170r/min)培養(yǎng)96h后,發(fā)酵終點(diǎn)的菌體用pH4.5的醋酸-醋酸銨緩沖溶液洗滌、重懸后定容至50mL,于冰浴條件下超聲破碎細(xì)胞(超聲破碎條件:變幅桿末端直徑Υ10,工作時(shí)間2s,間隔時(shí)間4s,全程凈超聲時(shí)間20min,輸出功率400W),離心去除沉淀,上清液即為粗酶液。1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建精密稱取經(jīng)105℃干燥3h的甘草酸單銨鹽對照品30.5mg,用50%乙醇定容于50mL容量瓶中,使?jié)舛葹?.61mg·mL1.2.3氯化鈣/質(zhì)酸鹽復(fù)合鹽在5搖床的制作將8mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%海藻酸鈉溶液與2mL酶活力為1600U的酶液充分混合均勻后,加入體積分?jǐn)?shù)為0.2%的戊二醛溶液,在4℃搖床中振蕩30min后,置于4℃冰箱中靜置交聯(lián)2h后,用蠕動(dòng)泵以20滴/min的滴速滴入質(zhì)量濃度為20g/L氯化鈣溶液中,立即有凝膠狀小球生成,更換氯化鈣溶液于4℃冰箱中硬化2h,然后將小球?yàn)V出,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%氯化鈉溶液(生理鹽水)洗滌3次,再用蒸餾水沖洗2次,用吸水紙吸干表面水分,稱重,貯存于4℃冰箱中1.2.4游離酶活性與固定化酶活性的測定1.2.4.含有甘草酸濃度的酶活力測定方法如下:200μL粗酶液加入到800μL含有甘草酸濃度2mg·mLβ-葡萄糖醛酸苷酶的活力(U):在上述條件下,1mL酶液每小時(shí)分解消耗1μg甘草酸的量定義為一個(gè)酶活力單位。1.2.4.制備固定化酶固定化酶活力的測定只要將1.2.4.1項(xiàng)中200μL粗酶液用200μL蒸餾水和一定量的固定化酶來代替,其余步驟相同。固定化酶的相對酶活力,指在同組實(shí)驗(yàn)中以活性最高的為100,與其余的固定化酶活力之比,以百分?jǐn)?shù)表示。酶活力回收率=(固定化酶活力÷投入的游離酶活力)×1002結(jié)果與分析2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線通過測定的吸光度值,以吸光度對溶液中甘草酸濃度進(jìn)行回歸分析,得甘草酸對照品濃度Y(mg·mL2.2不同因素對葡萄糖乙酸鈉酶的影響2.2.1海藻酸鈉固定化酶成球效果配制質(zhì)量濃度分別為10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L的海藻酸鈉溶液,在相同條件下制備固定化酶。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的海藻酸鈉溶液制備成的固定化酶,成球效果差異較大,結(jié)果如表1所示。海藻酸鈉的濃度不僅影響到凝膠小球的機(jī)械強(qiáng)度和成球的難易程度,而且影響酶的固定率,由圖2可看出,固定化酶的相對酶活力隨著海藻酸鈉的濃度增大而提高,當(dāng)海藻酸鈉的質(zhì)量濃度達(dá)到35g/L時(shí),固定化酶的相對酶活力達(dá)到最大值。但隨著海藻酸鈉的濃度增加,固定化酶的相對酶活力反而下降。這是由于隨著海藻酸鈉濃度的增加,載體的機(jī)械強(qiáng)度也會(huì)增大,表面更加致密,影響著底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散,進(jìn)而影響了固定化酶的活性。因此,海藻酸鈉濃度以35g/L最佳。2.2.2戊二醛對固定化酶的相對酶活力的影響在其他固定化條件相同的情況下,分別加入0.1%~1.6%不同體積分?jǐn)?shù)的戊二醛,比較所制備的固定化酶的相對酶活力,結(jié)果如圖3所示。由圖表明,固定化酶的相對酶活隨著戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而提高,當(dāng)戊二醛體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.20%時(shí),固定化酶的相對酶活力達(dá)到最大值。但隨著戊二醛體積分?jǐn)?shù)的增加,雖然其穩(wěn)定性仍然保持得很好,但固定化酶的相對酶活力卻明顯下降。因?yàn)槲於┘仁墙宦?lián)劑,又是酶蛋白的變性劑,因此,它的使用量直接影響到酶的固定率和穩(wěn)定性。低濃度的戊二醛使得海藻酸鈉分子交聯(lián)及酶交聯(lián)到載體上的程度不夠,所以酶的固定率、穩(wěn)定性和強(qiáng)度均不高。但過高濃度的戊二醛會(huì)使海藻酸鈉載體交聯(lián)度過大,形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)太緊密而限制了底物和反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)散,使得相對酶活性降低;同時(shí),過高濃度的戊二醛會(huì)與酶蛋白過度交聯(lián),導(dǎo)致活性中心的改變而使酶失活。通過本試驗(yàn)確定了較適宜的戊二醛體積分?jǐn)?shù)為0.20%。2.2.3提高固定化酶的相對酶活力通過在不同氯化鈣濃度下,比較所制備的固定化酶的相對酶活力,結(jié)果如圖4所示,氯化鈣質(zhì)量濃度從5g/L增加到10g/L時(shí),固定化酶的相對酶活力顯著提高;從10g/L增加到20g/L時(shí),相對酶活力增加幅度減緩,并于20g/L時(shí)達(dá)到最大值,之后,隨著氯化鈣濃度的增加,相對酶活力開始下降。顯然,過低的鈣離子濃度形成的凝膠網(wǎng)狀孔徑比較大,截留住的酶比較少,而過高的鈣離子濃度又會(huì)使網(wǎng)狀孔徑過小,高分子聯(lián)結(jié)較緊密,在酶促反應(yīng)時(shí),底物擴(kuò)散阻力增加。所以,質(zhì)量分?jǐn)?shù)20g/L的氯化鈣為最佳。2.2.4固定化酶的相對酶活力下降通過在不同交聯(lián)時(shí)間下,比較所制備的固定化酶的相對酶活力,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。由圖表明,當(dāng)交聯(lián)時(shí)間由1h增長到1.5h時(shí),固定化酶的相對酶活力有較大幅度的增長。在2h時(shí)達(dá)到最大值,超過2h后,固定化酶的相對酶活力呈下降趨勢。原因是交聯(lián)時(shí)間過短不能達(dá)到很好的凝膠效果,時(shí)間過長使交聯(lián)程度高,高分子鏈結(jié)較致密,底物擴(kuò)散阻力增加,酶活降低。同時(shí),酶由膠囊內(nèi)向外擴(kuò)散,固定化時(shí)間過長,酶泄露會(huì)增加,導(dǎo)致包埋率低。交聯(lián)5h效果較好,較長的交聯(lián)時(shí)問將導(dǎo)致顆粒表面的聚電解質(zhì)膜更加致密,底物擴(kuò)散困難,從而造成固定化相對酶活力降低。因此,交聯(lián)時(shí)間以2h為最佳。2.2.5固化時(shí)間對凝膠組織化學(xué)的影響通過在不同固化時(shí)間下,比較所制備的固定化酶的相對酶活力,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖8所示。由圖可知,固化時(shí)間在1~2h之間時(shí),由于時(shí)間較短,凝膠小球的固定化不夠充分,機(jī)械強(qiáng)度不是很強(qiáng)。但超過了2h后,隨著時(shí)間的延長,相對酶活力逐步下降。這是由于海藻酸鈉與氯化鈣形成凝膠是Ca2.3各因素對固定化-葡萄糖醛酸苷酶酶活回收率的影響在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,確定海藻酸鈉濃度、戊二醛體積分?jǐn)?shù)、氯化鈣濃度和交聯(lián)時(shí)間作為實(shí)驗(yàn)因素因子,每個(gè)因素取3個(gè)水平,對固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的酶活回收率影響進(jìn)行了L正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,各因素對固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的酶活回收率影響次序?yàn)?海藻酸鈉質(zhì)量濃度(A)>氯化鈣質(zhì)量濃度(C)>交聯(lián)時(shí)間(D)>戊二醛體積分?jǐn)?shù)(B)。從正交表中直接可以看到β-葡萄糖醛酸苷酶的最優(yōu)固定化工藝是:A3最佳工藝條件的確定本文圍繞“海藻酸鈉固定化β-葡萄糖醛酸苷酶的研究”,通過單因素實(shí)