準備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（作為對照組）和選擇培養(yǎng)基。將菌液稀釋相同倍數(shù)（見教材23頁“樣品稀釋流程示意圖”）。稀釋倍數(shù)為103～107。每個稀釋度均用3個選擇培養(yǎng)基，1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，共需要15個選擇培養(yǎng)基，5個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（都作好標識）。（2）制備培養(yǎng)基

（3）高溫消毒

將準備好培養(yǎng)基和8支試管、一支移液管（用紙包好）放到高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)進行滅菌處理。土壤微生物的分離和計數(shù)專家講座第1頁

將10g土樣加入盛有90mL無菌生理鹽水錐形瓶中（錐形瓶體積為250mL），充分搖勻，吸收上清液1mL，轉(zhuǎn)移至盛有9mL生理鹽水無菌大試管中，依次等比稀釋至107稀釋度，并按照由107～103稀釋度次序分別吸收0.1mL進行平板涂布操作。按照濃度從低到高次序涂布平板。（4）微生物培養(yǎng)與觀察

將涂布好培養(yǎng)皿放在30℃溫度下培養(yǎng)。伴隨培養(yǎng)時間延長，會有不一樣菌落產(chǎn)生。比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落數(shù)量、形態(tài)等，并做好統(tǒng)計。土壤微生物的分離和計數(shù)專家講座第2頁

挑選選擇培養(yǎng)基中不一樣形態(tài)菌落接入含酚紅培養(yǎng)基斜面中，觀察能否產(chǎn)生如書本中圖2-10顏色反應。（5）細菌計數(shù)

選取菌落數(shù)在30～300平板進行計數(shù)。在同一稀釋度下，最少對3個平板進行重復計數(shù)，然后求出平均值，并依據(jù)平板所對應稀釋度計算出樣品中細菌數(shù)目。土壤微生物的分離和計數(shù)專家講座第3頁二、結(jié)果分析與評價

1.培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落對照培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基菌落數(shù)目顯著大于選擇培養(yǎng)基數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。土壤微生物的分離和計數(shù)專家講座第4頁2.樣品稀釋操作是否成功假如得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30～300平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落計數(shù)。3.重復組結(jié)果是否一致假如各位同學選取是同一個土樣，統(tǒng)計結(jié)果應該靠近。假如結(jié)果相差太遠，則需要從各項操作過程中去分析、尋找可能原因。土壤微生物的分離和計數(shù)專家講座第5頁三、課題延伸

能分解尿素細菌判定判定原理：細菌合成脲酶將尿素分解成氨，會使培養(yǎng)基pH升高。判定方法：在以尿素為唯一氮源培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，利用此培養(yǎng)基進行細菌培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基顏色改變。土壤微生物的分離和計數(shù)專家講座第6頁分解纖維素微生物分離（一）纖維素與纖維素酶纖維素：一個由葡萄糖首尾相連而成高分子化合物，廣泛地存在于植物根、莖、葉等器官中。纖維素酶：由微生物分泌一個復合酶，包含C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，因為它們協(xié)同作用，最終將纖維素分解成葡萄糖。纖維素C1酶Cx酶纖維二糖葡萄糖苷酶葡萄糖土壤微生物的分離和計數(shù)專家講座第7頁①取二支20mL試管試驗：纖維素酶分解纖維素試驗②各加入一張濾紙條③各加入10mL0.1mol/L醋酸－醋酸鈉緩沖液甲乙④在甲試管中加入1mL蒸餾水，乙試管加入1mL纖維素酶⑤將試管放在140r/min搖床上振蕩1h⑥結(jié)果：乙試管濾紙條消失討論：乙試管濾紙條為何會消失？甲試管作用是什么？土壤微生物的分離和計數(shù)專家講座第8頁剛果紅染色法剛果紅能與纖維素形成紅色復合物，而不與水解后纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應。（二）纖維素分解菌篩選用加入剛果紅纖維素培養(yǎng)基去培養(yǎng)微生物時，假如培養(yǎng)基中出現(xiàn)以菌落為中心透明圈時，可說明該菌落是纖維素分解菌，因為它已將被剛果紅染成紅色纖維素分解了。土壤微生物的分離和計數(shù)專家講座第9頁一、實驗設計請你依據(jù)試驗流程圖和提供三個資料以及“操作提醒”，在思索相關問題基礎上，設計出一個詳細試驗方案。土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布在判別纖維素分解菌培養(yǎng)基上篩選產(chǎn)生透明圈菌落土壤微生物的分離和計數(shù)專家講座第10頁土壤中纖維素分解菌分離

1.土樣采集

：土樣采集方法與本專題課題2類似。土樣采集要選擇富含纖維素環(huán)境，這是因為在纖維素含量豐富環(huán)境，通常會聚集較多分解纖維素微生物。假如找不到適當環(huán)境，能夠?qū)V紙埋在土壤中，過一個月左右也會有能分解纖維素微生物生長。二、實驗案例土壤微生物的分離和計數(shù)專家講座第11頁2.選擇培養(yǎng)

：選擇培養(yǎng)需要儀器有：250mL錐形瓶、無菌稱量瓶、藥匙、1mL和10mL移液管、天平、搖床、溫度計等。在250mL錐形瓶中裝入30mL選擇培養(yǎng)基，用8層紗布做成瓶塞，將瓶口塞緊，再在瓶塞外包裹兩層包裝紙，用線繩扎緊，在121℃下高壓蒸汽滅菌20min。選擇培養(yǎng)操作：稱取土樣20g，在無菌條件下加入裝有30mL培養(yǎng)基搖瓶中。將搖瓶置于搖床上，在30℃下振蕩培養(yǎng)1～2d，至培養(yǎng)基變混濁，重復上述方法再培養(yǎng)一次，然后再進行梯度稀釋和涂布平板。土壤微生物的分離和計數(shù)專家講座第12頁3.剛果紅染色法分離：纖維素分解菌這一步所需要儀器有：無菌培養(yǎng)皿、涂布器、1mL移液管，裝有9mL無菌水20mL大試管，溫箱等。培養(yǎng)基制備參考書本旁欄中百分比配制。在500mL三角瓶中裝入200mL培養(yǎng)基，在121℃下高壓蒸汽滅菌20min。倒平板操作：將滅菌后固體培養(yǎng)基熔化，按無菌操作要求，在無菌培養(yǎng)皿中倒入15～20mL培養(yǎng)基，凝固后待用。土壤微生物的分離和計數(shù)專家講座第13頁

涂布平板：將稀釋度為104～106菌懸液各取0.1mL，滴加在平板培養(yǎng)基上，用涂布器將菌液涂布均勻，在30℃倒置培養(yǎng)，至菌落長出。每個稀釋度下需涂布3個平板，并注意設置對照。剛果紅染色詳細操作步驟參考書本［資料三］。

制備菌懸液：按照本專題課題1稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后培養(yǎng)基進行等比稀釋，稀釋最大倍數(shù)至106。土壤微生物的分離和計數(shù)專家講座第14頁三、結(jié)果分析與評價1.培養(yǎng)基制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落對照培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。假如觀察到