清腸溫中方調(diào)控dss誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠h17reg免疫平衡及腸黏膜屏障的作用機(jī)制

潰瘍性胃炎（iu）是一種嚴(yán)重的腸病，主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、粘膜膿血便等，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。1材料和方法1.1動物、環(huán)境、溫度24只健康SPF級SD雄性大鼠,體質(zhì)量(180±220)g,購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2016-0002,飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院動物房。12h光照/黑夜循環(huán),溫度20～24℃,濕度50%～60%;自由飲食飲水飼養(yǎng)。1.2青莎草粉添加量清腸溫中方配方顆粒:黃連6g,炮姜10g,三七6g,青黛6g,地榆炭15g,苦參15g,木香6g,炙甘草6g。由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院配方顆粒藥房統(tǒng)一購于北京康仁堂藥業(yè)有限公司。1.3便潛血熱試試葡聚糖硫酸鈉(MW36-50KDa;MPBiomedical,Burlingame,CA,USA),便潛血試紙(珠海貝索生物技術(shù)有限公司);ZO-1抗體(Santacruz,SC-8146),Occludin抗體(Abcam,Ab31721)。1.4模型、圖紙和樣品采集動物模型的建立方法如前期研究1.5逆轉(zhuǎn)錄條件按照TRIzolRegent說明書提取RNA。miR-675-5p的逆轉(zhuǎn)錄引物為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGTGTGC-3′。逆轉(zhuǎn)錄條件為42℃,60min,72℃5min。逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測miR-675-5p的表達(dá),以U6作為內(nèi)參,引物序列見表1,采用21.6腸胃內(nèi)vdrmnmna、孤核受體rort和叉頭蛋白p3坊p的mrna顯示提取結(jié)腸組織樣本的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后,采用21.7esi顯示了血清中白細(xì)胞介素10il-10和白細(xì)胞介素17il-17的發(fā)現(xiàn)應(yīng)用大鼠IL-10、IL-17酶聯(lián)免疫試劑盒檢測大鼠血清IL-10、IL-17的濃度。1.8檢測occludin抗體表達(dá)4μm厚石蠟切片經(jīng)過脫蠟、復(fù)水、高壓修復(fù)、封閉后,加入一抗(ZO-1抗體濃度1∶500,Occludin抗體濃度1∶500)、二抗,經(jīng)過顯色、復(fù)染、脫水、封片后,200倍鏡視野下采集圖片,Imageproplus6.0軟件分析圖像,計算光密度和染色區(qū)域總面積,用平均光密度(IOD/area)來進(jìn)行統(tǒng)計分析。1.9正態(tài)分布/方差齊性檢驗s應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以(ue0af±s)表示,符合正態(tài)分布且方差齊進(jìn)行單因素方差分析(One-wayANOVA),不符合正態(tài)分布或方差不齊進(jìn)行非參數(shù)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1大鼠結(jié)腸mir-975-5p、vdrmna的表達(dá)見表3。空白組第8號大鼠在實驗第3天不明原因死亡,其余大鼠均耐受實驗干預(yù)措施,直至實驗結(jié)束。模型組大鼠結(jié)腸組織miR-675-5p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),VDRmRNA的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與模型組比較,清腸溫中方組大鼠結(jié)腸組織miR-675-5p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),VDRmRNA的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。2.2式神經(jīng)原因?qū)嶒瀋p3mrna,cp3mrna表達(dá)水平見表4。與空白組比較,模型組大鼠結(jié)腸組織RORγtmRNA的表達(dá)水平明顯增高(P<0.05),而Foxp3mRNA的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與模型組比較,清腸溫中方組大鼠結(jié)腸的RORγtmRNA的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),而Foxp3mRNA的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。2.3血清il-17、c見表5。與空白組比較,模型組大鼠血清IL-10明顯降低(P<0.01),而血清IL-17明顯升高(P<0.05)。清腸溫中方干預(yù)后,血清IL-10明顯升高(P<0.05),而血清IL-17明顯降低(P<0.05)。2.4各組zo-1、occludin的比較空白組大鼠結(jié)腸組織中的ZO-1、Occludin陽性表達(dá)較多,模型組中ZO-1、Occludin陽性表達(dá)區(qū)域明顯減少,經(jīng)過治療后,清腸溫中方組較模型組的表達(dá)相對增強(qiáng),其組織切片陽性表達(dá)染色主要為深棕黃色或褐色,見圖1、圖2。與空白組比較,模型組ZO-1、Occludin的平均光密度明顯降低(P<0.05);清腸溫中方治療后,大鼠結(jié)腸的ZO-1、Occludin平均光密度較模型組顯著增加(P<0.05或P<0.01),見表6。3模型大鼠腸黏膜屏障修復(fù)的意義UC是一種病變局限于黏膜及黏膜下層的結(jié)腸及直腸的慢性非特異性炎癥性疾病,典型的臨床癥狀為黏液膿血便,其病因尚不明確清腸溫中方是本文指導(dǎo),北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院李軍祥教授根據(jù)多年治療UC總結(jié)的經(jīng)驗方,主要組成為:黃連6g,炮姜10g,青黛6g,苦參15g,三七6g,木香6g,地榆炭15g,炙甘草6g。本方以黃連、炮姜為君藥以清熱燥濕,溫脾止瀉;三七、苦參、青黛為臣藥以增強(qiáng)清熱燥濕之功,并兼化瘀止血之效;以木香、地榆炭為佐藥以行氣導(dǎo)滯、涼血止血;并以炙甘草為使藥以補(bǔ)益脾氣、調(diào)和諸藥。前期臨床、動物實驗MiR-675-5p是長鏈非編碼RNA(lncRNA)H19的直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,由LncRNAH19第一外顯子區(qū)編碼生成的。LncRNAH19的高表達(dá)可以增加miR-675-5p的釋放量,而miR-675-5p可以通過和下游靶基因VDRmRNA的3’UTR以非完全匹配方式相結(jié)合,從而干擾和抑制VDRmRNA的翻譯,同時還可以通過使靶基因VDRmRNA脫腺苷酸化的作用,增強(qiáng)其對靶基因VDRmRNA的降解,從而降低VDR的表達(dá)VDR是類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族的一員,是一類配體依賴性的轉(zhuǎn)錄因子,在人體中廣泛表達(dá)于各類細(xì)胞。VDR一方面可特異性地與維生素D(VD)結(jié)合,調(diào)節(jié)其內(nèi)生維生素D的活化形式,即維生素D-1,25(OH)Th17/Treg免疫平衡的失調(diào)是UC發(fā)病的主要因素因此,通過調(diào)控miR-675-5p/VDR信號通路修復(fù)UC大鼠腸黏膜屏障及調(diào)控Th17/Treg免疫平衡成為治療UC的新的方向。本次研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠結(jié)腸miR-675-5p、RORγtmRNA及血清IL-17的表達(dá)較空白組明顯增高,VDRmRNA、Foxp3mRNA、ZO-1、Occludin、血清IL-10的表達(dá)較空白組明顯降低,提示miR-675-5p/VDR信號通路參與了UC的發(fā)病過程,而經(jīng)過清腸溫中方的干預(yù)后,大鼠結(jié)腸miR-675-5p、RORγtmRNA及血清IL-17的表達(dá)較模型組明顯降低,而VDRmRNA、Foxp3mRNA、ZO-1、Occludin、血清IL-10的表達(dá)較模型組明顯升高,表明清腸溫中方可以通過降低miR-675-5p的表達(dá),靶向調(diào)控VD