海蘭蛋雞場(chǎng)雞疑似腫瘤病例的診斷與分析

馬立克病是水稻科的一種最常見的流行性疾病，具有周圍神經(jīng)和各種器官和組織的個(gè)別細(xì)胞浸潤。該病傳染性強(qiáng)，常給家禽生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失。禽白血?。╝vianleukosis,AL）是由禽白血病/肉瘤病毒群中的病毒引起的禽類的多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱，在自然條件下以淋巴白血病最為常見，世界各地均有本病存在，大多數(shù)雞群均有感染，但出現(xiàn)臨診癥狀的病雞數(shù)量較少2017年5月，南陽某養(yǎng)殖場(chǎng)雞群從80日齡出現(xiàn)發(fā)病癥狀，并出現(xiàn)死亡，至113日齡時(shí)雞群仍不斷死亡。養(yǎng)殖場(chǎng)主隨即來農(nóng)大禽病所就診，經(jīng)臨床癥狀、剖檢變化、分子生物學(xué)診斷等方法將該病例確診為禽白血病與馬立克氏病混合感染。1材料和方法1.1試劑和儀器1）病例。河南南陽某雞場(chǎng)海蘭蛋雞10000羽，發(fā)病雞群為113日齡，雞群從80日齡發(fā)病并出現(xiàn)零星死亡，零星死亡一直持續(xù)到100日齡（每天死亡1～2只），100～113日齡每天死亡5～8只。但雞群大體精神尚可，典型的變化是不斷有弱雞出現(xiàn)，這些雞精神沉郁、采食量低，極度消瘦或趨于消瘦；雞冠蒼白、皺縮，有的病雞可觸摸到腫大的肝。2）主要試劑。DNAMarkerDL2000、TaqDNA聚合酶、RRI、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶等均購自寶生物工程（大連）有限公司；RNA提取用TrizolLSReagent購自Invitrogen公司；瓊脂糖購自BIOWESTA-GAROSE公司。3）主要儀器。生物安全柜、酶標(biāo)儀購自ThermoFisherScientific公司；PCR儀購自北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；ECP3000三恒多用電泳儀購自北京六一儀器廠；紫外凝膠成像系統(tǒng)購自美國AlphaInnotech公司；Univeral32R高速冷凍離心機(jī)購自德國Hettich公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋購自國華電器有限公司。1.2安全性檢測(cè)及引物的設(shè)計(jì)1）臨床癥狀觀察。詢問養(yǎng)殖戶以及現(xiàn)場(chǎng)觀察病雞，并記錄發(fā)病癥狀。2）剖檢病變觀察。按照病理學(xué)常規(guī)方法剖檢病死雞，并記錄其典型的病理變化。3）病毒分離鑒定。(1)MDV的分離及引物設(shè)計(jì)。將來自河南南陽某雞場(chǎng)的腫瘤病送檢病料（脾和腫瘤組織）用研磨器無菌研磨（8000r/min,5min），按病料1∶5加入PBS液，病料反復(fù)凍融3次備用。然后采用酚—氯仿抽提法提取患病組織DNA，同時(shí)設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物如下，MDVUL19P5上游：5′-CCCGATATTAT-CATTKCHCC-3′和MDVUL19P6下游：5′-CTCG-CATTATTATCTGAAGT-3′，擴(kuò)增的DNA片段預(yù)期長度為521bp。(2)ALV和REV的分離及引物設(shè)計(jì)。因其出現(xiàn)貧血及腫瘤現(xiàn)象，利用組織血液RNA提取試劑盒提取患病組織RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)合成1對(duì)針對(duì)ALV特異性引物如下，ALVgp85U2上游：5′-GCCACCTCCCCTTTTCAA-3′和ALVgp85L2下游：5′-GAAAATTSCGGGTGGTAGC-3′，擴(kuò)增的DNA片段預(yù)期長度為778bp。同時(shí)，設(shè)計(jì)1對(duì)REV特異性引物如下，REV-1上游：5′-CATACTGGAGCCAATGGTT-3′和REV-2下游：5′-AATGTTGTACCGAAGTACT-3′，擴(kuò)增的DNA片段預(yù)期長度為291bp。2結(jié)果與分析2.1干/無光澤病雞主要癥狀為張嘴呼吸，雞冠發(fā)白，腳爪干瘦無光澤（圖1），精神沉郁、消瘦（圖2）。同時(shí)，可見部分病雞虹膜受到侵害導(dǎo)致失明，一側(cè)或兩側(cè)虹膜不正常，色彩消退。2.2節(jié)，結(jié)節(jié)，形節(jié)剖檢病雞主要見內(nèi)臟腫瘤：肝臟腫大，見有多個(gè)腫瘤結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)呈紐扣狀或其他形狀，大小不一，遍布肝臟（圖3）；脾臟腫大，可見腫瘤增生（圖4），腎臟局部腫大，腫瘤結(jié)節(jié)可見（圖5），個(gè)別肺部也出現(xiàn)腫大。2.3alv陽性的測(cè)定2)ALV和REV的PCR鑒定。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果顯示在約778bp處出現(xiàn)清晰的目的條帶（圖7），與預(yù)期的產(chǎn)物片段大小一致，即ALV陽性，但在291bp處未呈現(xiàn)相應(yīng)條帶（圖8），即REV陰性。根據(jù)該雞場(chǎng)雞群的發(fā)病情況、臨床癥狀、病理剖檢變化、PCR及RT-PCR結(jié)果顯示MDV陽性、ALV陽性、REV陰性等綜合分析，可確診該發(fā)病雞群為馬立克氏病病毒和禽白血病病毒混合感染。綜合以上檢查結(jié)果，確診該雞場(chǎng)雞群混合感染了馬立克氏病病毒和白血病病毒。3mdv和alv陽性nsclc-pcr檢測(cè)根據(jù)該雞場(chǎng)雞群的臨床表現(xiàn)：雞群精神沉郁、消瘦、雞冠發(fā)白、腳爪干瘦，發(fā)病日齡從80日齡至送診時(shí)不斷有病雞出現(xiàn)，而且病理剖檢可見肝臟、腎臟等臟器腫瘤結(jié)節(jié)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的PCR檢測(cè)結(jié)果證實(shí)該商品海蘭蛋雞群感染了馬立克氏病病毒和禽白血病病毒。馬立克氏病、禽白血病和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥均為禽病中常見的病毒性腫瘤病為進(jìn)行鑒別診斷，筆者進(jìn)行了REV的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)為陰性，而MDV和ALV陽性，進(jìn)一步排除了REV，支持了MD與AL共感染。這說明在實(shí)際家禽生產(chǎn)中還存在很多生物安全隱患，導(dǎo)致這些腫瘤性疾病發(fā)生；也暗示我國種禽場(chǎng)需要進(jìn)一步加強(qiáng)這些疾病的凈化，同時(shí)也應(yīng)加強(qiáng)對(duì)生產(chǎn)活疫苗廠家的監(jiān)管，以防通過劣質(zhì)疫苗引入這些疾病給雞群；更需要注意的是商品代養(yǎng)殖戶要提高自身