一種電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌的方法

本生物科學(xué)是一個重要的工業(yè)微生物。對其遺傳和生理特征的研究由來已久。coli對其遺傳背景和生理特征的研究是coli的標準。枯草芽孢桿菌能直接將目的基因產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中,且表達產(chǎn)物可溶、可正確折疊,具有生物活性,同時表達產(chǎn)物與胞內(nèi)蛋白分離,無需破碎細胞,利于分離純化,是極具應(yīng)用前景的基因表達宿主。但是,在枯草芽孢桿菌工程菌構(gòu)建過程中,能自發(fā)形成感受態(tài)的菌株極少,且感受態(tài)持續(xù)時間短暫,分子克隆效率低,從而限制了外源蛋白在枯草芽孢桿菌中的高效表達。目前外源基因?qū)胨拗骶闹饕侄斡懈惺軕B(tài)法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和電擊轉(zhuǎn)化法。其中,電擊轉(zhuǎn)化法被認為是轉(zhuǎn)化效率最高的一種方法。然而,電擊轉(zhuǎn)化過程中需要平衡轉(zhuǎn)化效率和死亡率的關(guān)系,隨著電場強度的增加,外源DNA進入宿主細胞的可能性越大,死亡率也隨之增加。陸雁等以不同預(yù)培養(yǎng)時間優(yōu)化復(fù)制子轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌WB600中,最高轉(zhuǎn)化率為2.58×104cfu/μg;王培培等對枯草芽孢桿菌NCD電轉(zhuǎn)化條件進行優(yōu)化,最高效率為6.07×104cfu/μg;而目前芽孢桿菌電擊轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化效率最高為1.4×106cfu/μg,還不能滿足高效率轉(zhuǎn)化,如構(gòu)建基因文庫的要求。本實驗通過對枯草芽孢桿菌制備感受態(tài)時生長狀態(tài)、穿梭載體加入量、回復(fù)培養(yǎng)基、電擊轉(zhuǎn)化緩沖液以及電擊時電壓的選擇等方面條件的優(yōu)化,使枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化率增大,為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1phy-p治療枯草芽孢桿菌WB600、大腸桿菌JM109、穿梭載體pHY-p43均由江南大學(xué)生物工程學(xué)院余曉斌教授(實驗室)惠贈;分子生物學(xué)試劑及試劑盒均購買于生工生物(上海)股份有限公司,其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.1.2氯化鈉nacl、瓊脂粉質(zhì)量濃度LB液體培養(yǎng)基的制備方法:胰蛋白胨質(zhì)量濃度為10g/L,酵母提取物質(zhì)量濃度為5g/L,氯化鈉質(zhì)量濃度為10g/L,pH值為7.2。LB固體培養(yǎng)基的制備方法:胰蛋白胨質(zhì)量濃度為10g/L,酵母提取物質(zhì)量濃度為5g/L,氯化鈉(NaCl)質(zhì)量濃度為10g/L,瓊脂粉質(zhì)量濃度為1.5g/L,pH值為7.2。SLB培養(yǎng)基的制備方法:蛋白胨質(zhì)量濃度為10g/L,酵母粉質(zhì)量濃度為5g/L,NaCl質(zhì)量濃度為10g/L,山梨醇的濃度為0.5mol/L,pH值為7.2。ORM培養(yǎng)基的制備方法:蛋白胨質(zhì)量濃度為10g/L,酵母粉質(zhì)量濃度為5g/L,NaCl質(zhì)量濃度為10g/L,山梨醇的濃度為0.8mol/L,pH值為7.2。RM培養(yǎng)基的制備方法:蛋白胨質(zhì)量濃度為10g/L,酵母粉質(zhì)量濃度為5g/L,NaCl質(zhì)量濃度為10g/L,山梨醇的濃度為0.5mol/L,pH值為7.2。1.1.3山梨醇、甘露醇的制備氨芐青霉素:儲存濃度為50mg/mL,工作濃度為50μg/mL;四環(huán)素:儲存濃度為5mg/mL,工作濃度為50μg/mL;SMG緩沖液:0.5mol/L山梨醇,0.5mol/L甘露醇,10g/L甘油。使用去離子水配制,121℃滅菌20min;SG緩沖液:0.5mol/L山梨醇,10g/L甘油,使用去離子水配制,121℃滅菌20min;MG緩沖液:0.5mol/L甘露醇,10g/L甘油,使用去離子水配制,121℃滅菌20min;Gly緩沖液:10g/L甘油,使用去離子水配制,121℃滅菌20min。1.2細胞培養(yǎng)和分離從4℃冰箱中取出保藏的枯草芽孢桿菌WB600,活化菌株;用移液槍吸取1mL過夜培養(yǎng)物在無菌凈化臺接種于40mLSLB培養(yǎng)基中,37℃,200r/min振蕩培養(yǎng)至OD600nm=0.7;將菌液冰水浴10min后,放入離心管中,4℃,5000r/min離心5min,棄上清,收集細胞;在無菌凈化臺上用0℃預(yù)冷的40mLSMG緩沖液通過移液槍吹懸步收集的細胞,4℃,5000r/min離心5min,棄上清,收集細胞,漂洗4次;用2mLSMG緩沖液吹懸收集的細胞,分裝于離心管(60μL/管)中,-80℃保存,每管約有6×108個感受態(tài)細胞。1.3質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳的制備取50ngpHY-P43質(zhì)粒DNA,加入到1管感受態(tài)細胞中,在冰上通過移液槍輕微吐吸使pHY-P43質(zhì)粒DNA和感受態(tài)細胞充分混勻,冰浴2min;將體系轉(zhuǎn)移至0℃預(yù)冷的電擊杯(1mm)中,用電轉(zhuǎn)儀進行電擊(電壓21kV/cm,電容25μF,電阻200Ω,電擊1次,時間常數(shù)=5ms);立即向電擊杯中加入1mLORM培養(yǎng)基,通過移液槍反復(fù)輕輕吹打混勻;將電擊杯中的菌液全部吸出至離心管中,37℃,200r/min振蕩培養(yǎng)2小時后,將培養(yǎng)體系涂布于含有氨芐青霉素和四環(huán)素的LB固體培養(yǎng)基平板,37℃,過夜培養(yǎng)。然后隨機挑取生長出來的單克隆,提取質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳,在5kb左右可見清晰的質(zhì)粒條帶,說明驗證轉(zhuǎn)化成功。計數(shù)菌落,計算轉(zhuǎn)化率,轉(zhuǎn)化率為每μg質(zhì)粒DNA產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子數(shù)。2結(jié)果與討論2.1質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳根據(jù)1.4節(jié)的步驟將pHY-p43轉(zhuǎn)化至WB600中,電擊后涂布在含有終濃度為50μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL四環(huán)素的LB固體培養(yǎng)基平板,37℃,過夜培養(yǎng)。然后隨機挑取生長出來的單克隆,提取質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果如圖1所示,在5kb左右有清晰可見的質(zhì)粒的條帶,說明轉(zhuǎn)化成功。在平板上計數(shù)轉(zhuǎn)化子數(shù)量,平均轉(zhuǎn)化率為5.0×105cfu/μg。2.2感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化為了考察枯草芽孢桿菌不同的生長狀態(tài)對感受態(tài)的制備和后期轉(zhuǎn)化的影響,培養(yǎng)細胞OD600值分別為0.3,0.5,0.7,0.9,1.1,1.3和1.5時,收集細胞,根據(jù)感受態(tài)制備方法,制備不同生長時期的感受態(tài)。將穿梭載體pHY-p4350ng通過電擊轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞中,涂布于氨芐青霉素和四環(huán)素的LB固體培養(yǎng)基平板,計數(shù)轉(zhuǎn)化菌落,計算轉(zhuǎn)化率。由圖2可知:當(dāng)OD600值為0.7時,轉(zhuǎn)化率達到最高,平均為9.8×105cfu/μg。2.3擊穿載體的選擇在優(yōu)化穿梭載體加入量的影響時,選擇了枯草芽孢桿菌生長OD值為0.7時制備感受態(tài)。在點擊轉(zhuǎn)化中分別加入20,40,60,80,100和120ng的穿梭載體pHY-p43,再進行電擊轉(zhuǎn)化,計算轉(zhuǎn)化率。由圖3可知:當(dāng)穿梭載體的加入量為80ng以上時,轉(zhuǎn)化達到平衡為2.3×106cfu/μg,所以最終選擇的載體的加入量為80ng。2.4山梨醇濃度對轉(zhuǎn)化率的影響在OD600值為0.7時收集細胞用于感受態(tài)細胞的制備,在電擊轉(zhuǎn)化步驟時加入80ng的穿梭載體進行電轉(zhuǎn)化;電擊完成后向電擊杯中加入1mL回復(fù)培養(yǎng)基,選擇的山梨醇濃度分別為0.2,0.4,0.6,0.8,1和1.2mol/L,其余實驗條件與優(yōu)化前相同。實驗結(jié)果如圖4所示:當(dāng)山梨醇濃度為0.8mol/L時,轉(zhuǎn)化率達到最大值為3.1×106cfu/μg;當(dāng)山梨醇的濃度大于0.8mol/L時,轉(zhuǎn)化效率快速下降,這可能是因為山梨醇濃度過大影響了細胞的滲透壓。2.5進行電轉(zhuǎn)化后的體在OD600值為0.7時收集細胞用于感受態(tài)細胞的制備,在電擊轉(zhuǎn)化步驟時加入80ng的穿梭載體進行電轉(zhuǎn)化;電擊完成后向電擊杯中加入1mL回復(fù)培養(yǎng)基,回復(fù)培養(yǎng)基中山梨醇濃度為0.8mol/L,選擇不同的電擊轉(zhuǎn)化緩沖液:SMG、SG、MG、Gly,其余實驗條件與優(yōu)化前相同,如圖5所示。結(jié)果表明:使用SMG緩沖液作為電轉(zhuǎn)緩沖液時轉(zhuǎn)化率最高,可達4.5×106cfu/μg。2.6電轉(zhuǎn)化單元lm在OD600值為0.7時收集細胞用于感受態(tài)細胞的制備,將制備的感受態(tài)細胞用SMG緩沖液重懸,在電擊轉(zhuǎn)化步驟時加入80ng的穿梭載體進行電轉(zhuǎn)化;電擊完成后向電擊杯中加入1mL回復(fù)培養(yǎng)基,其中的山梨醇濃度為0.8mol/L。選擇不同的電壓進行電轉(zhuǎn)化操作:12kV/cm、15kV/cm、18kV/cm、21kV/cm、24kV/cm,其余實驗條件與優(yōu)化前相同。由圖5可知:在電壓為21kv/cm時轉(zhuǎn)化率最高,為8.0×106