攜帶pen基因的長雙歧桿菌的構(gòu)建及抑瘤作用研究

實(shí)體瘤的目標(biāo)治療是腫瘤基因治療的難題。根據(jù)近年來的研究，兩種不同的細(xì)菌可以在實(shí)體瘤的低氧區(qū)域種植和繁殖，這可以改善腫瘤的靶性。由于雙歧桿菌是人類腸道內(nèi)的正常益生菌群,該菌是人體腸道內(nèi)的生物學(xué)屏障,不僅可以合成多種維生素、控制內(nèi)毒素血癥、抑制腐敗細(xì)菌在腸道中腐化、抗感染及預(yù)防腹瀉等,而且具有一定的抗腫瘤和預(yù)防癌變的功能,對維持人體健康具有重要作用,因此利用基因工程技術(shù)改造雙歧桿菌使其應(yīng)用于實(shí)體瘤靶向治療的研究成為熱點(diǎn)。國外學(xué)者已經(jīng)從各種雙歧桿菌中分離到多個(gè)質(zhì)粒,但文獻(xiàn)報(bào)道中應(yīng)用于雙歧桿菌基因工程研究的多為pMB1和pTB6,國內(nèi)學(xué)者用大腸桿菌表達(dá)載體構(gòu)建的雙歧桿菌基因工程菌株雖已表達(dá)了外源基因,但質(zhì)粒復(fù)制和基因表達(dá)的穩(wěn)定性難以保證。目前,合成寡核苷酸引物的成本下降,利用多條相互重疊的引物通過PCR法合成全基因已有成功的報(bào)道。為了獲得在雙歧桿菌基因工程研究和生產(chǎn)中具有長期、廣泛應(yīng)用價(jià)值的表達(dá)載體,同時(shí)避開從雙歧桿菌中分離、鑒定、分析和改造質(zhì)粒的繁瑣過程,本研究通過PCR法合成已完成序列分析的雙歧桿菌質(zhì)粒pMB1(GenBank登記號:X84655),與大腸桿菌克隆載體pMD18-T連接,并加入HU啟動(dòng)子,構(gòu)建了大腸桿菌-長雙歧桿菌穿梭載體。據(jù)報(bào)道HU啟動(dòng)子可使雙歧桿菌中編碼自身類組蛋白的基因高效表達(dá)。PTEN(Phosphataseandtensinhomologuedeletedonchromosome10)基因是1997年克隆得到的定位于人類染色體10q23.3的抑癌基因,編碼403個(gè)氨基酸,蛋白大小約55kDa。PTEN蛋白是具有蛋白質(zhì)和酯類雙重特異性磷酸酶活性的抑癌因子,具有多種生物學(xué)功能:可催化第二信使分子3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)去磷酸化,從而拮抗Akt/PKB信號傳導(dǎo)通路,誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯;可增加p53蛋白的穩(wěn)定性;能與細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生相互作用而抑制細(xì)胞的遷移并可抑制實(shí)體瘤內(nèi)微血管的形成。本研究將已在大腸桿菌中成功表達(dá)的PTEN基因構(gòu)建到上述表達(dá)載體中并在雙歧桿菌中獲得表達(dá),證實(shí)了該載體可以有效表達(dá)外源基因,且攜帶PTEN基因的長雙歧桿菌可顯著抑制小鼠實(shí)體瘤的生長,為該系統(tǒng)在腫瘤靶向性基因治療中的應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1表達(dá)載體構(gòu)建大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α由本室保存,含PTENcDNA的質(zhì)粒pMD-PTEN及含有PTEN原核表達(dá)載體的工程菌BL21(DE3)/pET-PTEN為本室構(gòu)建和保存,長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)L17由本室分離、鑒定并保存,克隆載體pMD18-T購自TaKaRa公司。大腸桿菌DH5α采用常規(guī)液體和固體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。長雙歧桿菌采用改良MRS培養(yǎng)基,37℃厭氧培養(yǎng)(80%N2,10%CO2,10%H2)。1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、PyrobestDNA聚合酶、λDNA/EcoT14Marker、dNTP和膠回收試劑盒購自TaKaRa公司,質(zhì)粒提取試劑盒QIAprepSpin為Qiagen公司產(chǎn)品,溶菌酶、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記為上海Sangon公司產(chǎn)品,PTEN多克隆抗體(兔源)購自福州邁新公司,HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購自Novagen公司,氨芐青霉素為Amresco公司產(chǎn)品,硝酸纖維素膜為Amersham公司產(chǎn)品,其它試劑為國產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡昆明鼠由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號:SCXK(蒙)2002-0001,肝癌實(shí)體瘤小鼠由內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)用實(shí)體瘤小鼠由本室制作。引物合成與DNA測序由上海Sangon公司完成。1.2酶切位點(diǎn)基因tki分析擬合成的DNA片段命名為MH,全長1881bp,包括3部分:第一部分為質(zhì)粒pMB1序列,共1742bp,去掉了不影響其復(fù)制的第1～105個(gè)堿基;第二部分為長雙歧桿菌中hup(類組蛋白)基因起始密碼子及其上游的113bp序列,其中包含HU啟動(dòng)子;第三部分為方便載體構(gòu)建和驗(yàn)證的4個(gè)酶切位點(diǎn)及2個(gè)附加堿基,其序列為5′-CATATGGAATTCGGATCCCTCGAGCG-3′(26bp)。共設(shè)計(jì)和合成了48條引物,引物長45～61nt,相鄰兩條引物間重疊約15～21nt,參照Oligo6.0軟件分析結(jié)果,盡量避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu),引物序列見表1。1.3pcr產(chǎn)物的表達(dá)MH的合成按以下方案進(jìn)行:先利用引物1～引物16進(jìn)行PCR擴(kuò)增,合成650bp的片段MH1,反應(yīng)體系(50μL)如下:10×PyrobestBuffer5μL;dNTP(10mmol/Leach)1μL;引物1和引物16(10μmol/L)各1μL;引物2和引物15(5μmol/L)各1μL;引物3和引物14(2.5μmol/L)各1μL;引物4～引物13(1.25μmol/L)各1μL;PyrobestDNA聚合酶(5U/μL)1μL;補(bǔ)加27μLddH2O。同理利用引物17～引物32及引物33～引物48分別進(jìn)行PCR,合成664bp的片段MH2和612bp的片段MH3,反應(yīng)體系同上。PCR反應(yīng)條件都為94℃40s、50℃30s、72℃60s,25個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。將上述3種PCR產(chǎn)物電泳后切膠回收純化,分別與克隆載體pMD18-T連接,經(jīng)酶切、PCR初步檢測后,各挑取3個(gè)克隆測序。序列完全正確的質(zhì)粒分別命名為pMD-MH1、pMD-MH2和pMD-MH3。利用引物1和16、17和32及33和48,分別以pMD-MH1、pMD-MH2和pMD-MH3為模板進(jìn)行PCR,擴(kuò)增出MH1、MH2和MH33個(gè)片段,切膠回收純化后按以下體系進(jìn)行PCR:10×PyrobestBuffer5μL;dNTP(各10mmol/L)1μL;引物1和引物48(10μmol/L)各1μL;3種純化產(chǎn)物(2.5μmol/L)各1μL,PyrobestDNA聚合酶(5U/μL)1μL;補(bǔ)加38μLddH2O。反應(yīng)條件:94℃60s,52℃45s,72℃3min,25個(gè)循環(huán);72℃10min。PCR產(chǎn)物切膠回收純化,與克隆載體pMD18-T連接,經(jīng)酶切、PCR檢測后,挑取5個(gè)克隆測序。1.4質(zhì)粒提取與制備常規(guī)CaCl2法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α,穿梭質(zhì)粒pMB-HU轉(zhuǎn)化大桿菌DH5α后用氨芐青霉素(100μg/mL)篩選。長雙歧桿菌L17于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)中期,取40mL菌液,4℃收集菌體,用預(yù)冷10%甘油洗滌3次,400μL預(yù)冷10%甘油重懸后,取50μL(1.0×108～2.0×108CFU)與5μL質(zhì)粒(1.0～1.5μg)混合,移入預(yù)冷的電擊杯中冰浴5min,用電擊儀(Bio-Rad,USA)轉(zhuǎn)化,條件:2.0kV,25μF,200Ω,脈沖間隔4.5ms,處理后立即加入1mLMRS液體培養(yǎng)基,37℃厭氧培養(yǎng)5h,涂布于含氨芐青霉素(30μg/mL)的MRS固體培養(yǎng)基,37℃厭氧培養(yǎng)72h,未轉(zhuǎn)化的長雙歧桿菌為對照。1.5陽性克隆的檢測參照試劑盒說明書,用QIAprepSpin試劑盒從大腸桿菌DH5α中提取質(zhì)粒。從長雙歧桿菌L17中提取質(zhì)粒也使用該試劑盒,但在重懸菌體后加入終濃度為30mg/mL的溶菌酶,37℃保溫40min,其余操作參照說明書進(jìn)行。穿梭質(zhì)粒pMB-HU轉(zhuǎn)化大腸桿菌和長雙歧桿菌L17后的陽性克隆各傳代25次,每個(gè)陽性克隆分為2組,一組不加氨芐青霉素,另一組加氨芐青霉素,濃度同1.4。每組每代各取15個(gè)陽性克隆提取質(zhì)粒,經(jīng)PCR和酶切檢查其完整性,對于長雙歧桿菌L17每代均鏡檢鑒定。將L17中提取的質(zhì)粒再次電擊轉(zhuǎn)化長雙歧桿菌,方法同上,陽性克隆再傳代10次,按照上述方法提取質(zhì)粒并檢查其完整性。1.6pmb-hu-pten基因的構(gòu)建含有PTEN基因cDNA的質(zhì)粒pMD-PTEN1經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切,切膠回收1.2kb的片段(PTEN基因cDNA),與經(jīng)相同酶切并純化的質(zhì)粒pMB-HU過夜連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后用氨芐青霉素篩選,經(jīng)PCR、酶切、測序鑒定陽性克隆,序列正確的質(zhì)粒命名為pMB-HU-PTEN。從大腸桿菌中提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化長雙歧桿菌,轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定方法同上。1.7pten蛋白多克隆抗體的轉(zhuǎn)染含表達(dá)載體pMB-HU-PTEN的L17在含氨芐青霉素(30μg/mL)的MRS液體培養(yǎng)基中37℃厭氧培養(yǎng)36～48h,4000r/min離心15min(4℃)收集菌體,按照文獻(xiàn)所述方法裂解菌體,經(jīng)SDS分離樣品后,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉過夜封閉,一抗(兔源PTEN蛋白多克隆抗體,1∶1500)4℃孵育2h,洗膜3次;二抗(羊抗兔IgG,HRP標(biāo)記,1∶3000)室溫孵育90min,洗膜3次,DAB顯色。以未轉(zhuǎn)質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化穿梭質(zhì)粒pMB-HU的長雙歧桿菌為陰性對照,以本室構(gòu)建的含有PTEN原核表達(dá)載體的工程菌BL21(DE3)/pET-PTEN的誘導(dǎo)產(chǎn)物為陽性對照。1.8小鼠分組及處理取腫瘤生長旺盛的肝癌荷瘤小鼠,頸椎脫臼處死,無菌條件下取出瘤塊,仔細(xì)切碎組織,制成單細(xì)胞懸液,每只小鼠右前肢皮下注射癌細(xì)胞懸液0.5mL(濃度約2×107/mL),小鼠第5～7d成瘤。于第10d將小鼠隨機(jī)分為3組,每組20只。陰性對照組小鼠尾靜脈注射0.4mLPBS溶液,第10d、15d、20d各注射1次。實(shí)驗(yàn)組分為L17和L17/pMB-HU-PTEN組,將經(jīng)PBS洗滌3次的L17和L17/pMB-HU-PTEN以PBS調(diào)節(jié)活菌濃度為2.0×109/mL,每只小鼠尾靜脈注射0.4mL,注射時(shí)間同陰性對照組。第21d頸椎脫臼處死小鼠,解剖剝離瘤塊,稱瘤重。按公式計(jì)算抑瘤率:腫瘤抑制率=(對照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重)/對照組瘤重×100%,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1表達(dá)pmb1和hu啟動(dòng)子的鑒定首先通過PCR合成3個(gè)片段MH1、MH2和MH3,其大小分別為650bp、664bp和612bp,克隆后篩選出陽性質(zhì)粒pMD-MH1、pMD-MH2和pMD-MH3;第二輪PCR合成了全長1881bp的序列,其中含雙歧桿菌質(zhì)粒pMB1、HU啟動(dòng)子及設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn),經(jīng)純化后與克隆載體pMD18-T連接。測序結(jié)果表明,5個(gè)克隆中有2個(gè)序列完全正確的陽性克隆,其中1個(gè)為合成序列的正向插入,命名為pMB-HU。以上操作均以大腸桿菌DH5α為宿主,氨芐青霉素(100μg/mL)篩選。提取質(zhì)粒pMB-HU后,電擊轉(zhuǎn)化長雙歧桿菌L17,在氨芐青霉素工作濃度為30μg/mL時(shí)可有效篩選出陽性克隆,未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的對照組長雙歧桿菌在含有氨芐青霉素(30μg/mL)的MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)72h未見菌落形成。2.2加氨芐激素質(zhì)粒提取將穿梭質(zhì)粒pMB-HU轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,篩選出的15個(gè)陽性克隆傳代25次并提取質(zhì)粒,經(jīng)PCR和酶切鑒定結(jié)果表明:加氨芐青霉素傳代的克隆中,質(zhì)?？煞€(wěn)定復(fù)制和傳代,序列未發(fā)生明顯突變。未加氨芐青霉素傳代的克隆中,每次采用同樣的菌量提取質(zhì)粒,未見雜帶或彌散背景出現(xiàn),質(zhì)粒的得率在相鄰兩代之間未見明顯差異,但第25代提取的質(zhì)粒得率略小于第1代;PCR和酶切鑒定表明,質(zhì)粒序列無明顯改變。用同樣的檢測證實(shí)在加氨芐青霉素的培養(yǎng)基中,重組質(zhì)粒pMB-HU在長雙歧桿菌L17中可穩(wěn)定復(fù)制,但同樣條件下提取質(zhì)粒的得率低于DH5α,提示該宿主中質(zhì)?？截悢?shù)可能較低。在未加氨芐青霉素的培養(yǎng)基中,轉(zhuǎn)化后的L17經(jīng)傳代25次以后提取質(zhì)粒,仍可見清晰均一的條帶,質(zhì)粒大小不變,未見明顯序列突變,第25代的質(zhì)粒得率亦略小于第1代。將L17中提取的質(zhì)粒再次電擊轉(zhuǎn)化長雙歧桿菌,陽性克隆在含有和不含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中再傳代10次后提取質(zhì)粒進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒仍能穩(wěn)定復(fù)制,質(zhì)粒得率無明顯變化。2.3pten基因序列及測序質(zhì)粒pMD-PTEN經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后與質(zhì)粒pMB-HU連接,篩選出的陽性克隆中插入片段為PTEN基因cDNA,共1212bp,序列與已發(fā)表的PTEN基因序列(GenBank登記號:U93051)相同,命名為pMB-HU-PTEN。提取該質(zhì)粒后用電擊法轉(zhuǎn)化長雙歧桿菌L17,篩選出陽性克隆。2.4pten基因檢測將含有質(zhì)粒pMB-HU-PTEN的長雙歧桿菌培養(yǎng)48h后,裂解菌體,對總蛋白進(jìn)行Westernblot檢測,獲得1條分子量大小約為55kDa的特異性條帶,與PTEN基因在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)產(chǎn)物大小相同,而在未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒及轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pMB-HU的L17菌中未檢測到特異條帶(圖1),證實(shí)PTEN基因可在長雙歧桿菌L17中獲得表達(dá)。含質(zhì)粒pMB-HU-PTEN的L17經(jīng)5次傳代后進(jìn)行Westernblot檢測仍能獲得特異性條帶(圖1),表明該質(zhì)粒在L17中能穩(wěn)定復(fù)制并可持續(xù)表達(dá)外源基因。2.5小鼠實(shí)體瘤的抑瘤能力用尾靜脈法給荷瘤小鼠注射長雙歧桿菌L17和工程菌L17/pMB-HU-PTEN后,對供試小鼠實(shí)體瘤測量結(jié)果顯示,L17/pMB-HU-PTEN組小鼠的平均瘤重顯著低于PBS對照組(P<0.01),其抑瘤率為57.55%,而L17組抑瘤率為18.87%(表2),以上結(jié)果表明:雖然長雙歧桿菌自身具有一定的實(shí)體瘤抑制效果,但表達(dá)PTEN蛋白的長雙歧桿菌工程菌的實(shí)體瘤抑制效果有明顯提高。本室已有研究表明:大腸桿菌中表達(dá)的重組PTEN蛋白對小鼠實(shí)體瘤和癌細(xì)胞生長具有明顯的抑制作用(待發(fā)表資料),上述研究結(jié)果與此一致。3質(zhì)粒的合成及分子活性思想的確立雙歧桿菌用于腫瘤的靶向性基因治療最近受到了研究者的關(guān)注,但實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的前提是攜帶抑癌基因的質(zhì)粒能在雙歧桿菌中穩(wěn)定復(fù)制,目前采取的解決方案是:利用從長雙歧桿菌中分離到的質(zhì)粒和大腸桿菌中成熟的載體構(gòu)建含有雙歧桿菌復(fù)制起始序列的穿