小麥木聚糖酶活性的動(dòng)態(tài)變化及其基因表達(dá)

重金屬是環(huán)境因素重要的環(huán)境污染物。隨著工業(yè)化的發(fā)展和污染物排放量的增加，重金屬引起的生態(tài)危機(jī)和生態(tài)后果引起了人們的高度關(guān)注。重金屬脅迫下植物生長(zhǎng)發(fā)育的生理生化和分子機(jī)制已成為當(dāng)前的熱點(diǎn)。種子萌發(fā)既是小麥生活周期的起點(diǎn),也是小麥感知外界環(huán)境的最初生命階段,萌發(fā)是代謝開始活躍,一系列蛋白酶及水解酶活性逐漸增強(qiáng)的過程。木聚糖酶是一類半纖維素水解酶,也是萌發(fā)過程中一個(gè)關(guān)鍵酶,目前研究較多的是細(xì)菌、真菌來源的木聚糖酶,對(duì)植物來源木聚糖酶的研究報(bào)道還很少。Chrispeels等發(fā)現(xiàn)大麥等禾本科植物在種子萌發(fā)時(shí)木聚糖酶活性在其他水解酶如淀粉酶等活性降低時(shí)仍持續(xù)升高,Banik等證實(shí)了在大麥種子萌發(fā)過程中,β-1,4木聚糖酶在基因表達(dá)上晚于(1,3-1,4)-β-葡聚糖酶。另外,在大麥種子萌發(fā)和幼苗形成過程中,糊粉層細(xì)胞合成并分泌水解酶到淀粉性胚乳中,給正在生長(zhǎng)的胚提供營(yíng)養(yǎng),一旦完成它們的分泌作用,糊粉層細(xì)胞立即死亡,Caspers等通過試驗(yàn)證明細(xì)胞質(zhì)中的一種內(nèi)源β-1,4木聚糖酶在大麥(Hordeumvulgare)糊粉層程序性死亡中起重要作用。Bethke等認(rèn)為GA促進(jìn)糊粉層細(xì)胞水解酶的釋放,導(dǎo)致PCD(ProgrammedCellDeath)發(fā)生,而ABA拮抗GA作用,抑制水解酶分泌。周建明Nemoto、LiL等認(rèn)為干旱、高鹽、病害等逆境條件可使小麥dil基因、WESR基因(小麥早期鹽脅迫響應(yīng)基因)、幾丁質(zhì)酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因表達(dá)增強(qiáng)。由此可見,木聚糖酶在種子萌發(fā)過程以及植物抗逆方面都有一定的潛在作用。因此,研究逆境脅迫下小麥籽粒發(fā)芽過程中木聚糖酶活性及基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,對(duì)我們進(jìn)一步探討糊粉層細(xì)胞PCD的發(fā)生以及研究重金屬對(duì)植物的危害機(jī)理都具有重要意義。本試驗(yàn)選定重金屬As(Ⅲ)為脅迫因素,探討不同濃度As(Ⅲ)處理后小麥籽粒發(fā)芽過程中不同部位木聚糖酶活性的動(dòng)態(tài)變化,同時(shí)運(yùn)用半定量RT-PCR(Semi-QRT-PCR)方法研究籽粒發(fā)芽過程木聚糖酶基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化,為研究逆境脅迫對(duì)小麥木聚糖酶表達(dá)的分子機(jī)理提供依據(jù)。1材料和方法1.1木聚糖酶活性測(cè)定供試小麥(TriticumaestivumL.)品種為鄭州9023,供試試劑為NaAsO2(A.R.)。精選粒大飽滿的小麥籽粒,用0.1%HgCl2表面消毒6min,去離子水充分沖洗后,整齊地?cái)[放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中,每皿100粒,分別加入0(對(duì)照)、0.1、5、25mg/L的As(Ⅲ)溶液,每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù),置于HP1000GS-B型全智能人工植物氣候箱中在(18±2)℃,75%±7%RH,6000lx條件下培養(yǎng),每隔半天補(bǔ)充定量的As(Ⅲ)溶液。從培養(yǎng)48h開始間隔12h連續(xù)取樣,將取得的幼苗洗凈,用濾紙吸干,分離成籽粒、幼根、幼葉3個(gè)部位,測(cè)定木聚糖酶活性;從培養(yǎng)后96h開始間隔12h連續(xù)取樣,提取幼苗葉片的RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,半定量RT-PCR法研究木聚糖酶基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。1.2木聚糖酶活性測(cè)定取一定量新鮮的小麥籽粒、幼根及幼葉研磨,用pH5.3,0.05mol/L的檸檬酸緩沖液提取,8000r/min離心10min,在試管中加入2ml底物(1%樺木木聚糖Beechwood,Sigma),1ml提取酶液,DNS法測(cè)定木聚糖酶活性。以pH5.3條件下,50℃時(shí)每分鐘水解木聚糖釋放1μmol木糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位(U/g)。1.3小麥actin基因的擴(kuò)增和克隆用TRNzol試劑(TIANGEN)提取小麥幼葉的總RNA。(1)定量:測(cè)260、280nm處的吸光值,計(jì)算A260/A280的值,估計(jì)總RNA的純度,通過A260的值分別對(duì)不同取樣時(shí)間的總RNA進(jìn)行定量。(2)RNA完整性的檢測(cè):在1%普通瓊脂糖凝膠上分離總RNA,若有2條清晰無拖尾的帶,則說明總RNA完整。(3)第一鏈cNDA合成:取等量不同取樣時(shí)間的總RNA,用MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工)合成第一鏈cDNA。根據(jù)小麥Actin基因(GenBank查詢號(hào):gi:48927617)序列,設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物Actin-F:5′-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3′,Actin-R:5′-GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC-3′。PCR擴(kuò)增采用50μl反應(yīng)體系,分別加入等量不同取樣時(shí)間的cDNA(4μl)模板,10×PCRBuffer(100mmol/L的Tris-HCl,pH8.3,500mmol/L的KCl)2.5μl,80μmol/L的dNTP,1.5mmol/L的MgCl2,0.2mmol/L的Actin基因特異引物,1UTaqDNA聚合酶。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5min,94℃變性1min,57℃退火1min,72℃延伸1min,15個(gè)循環(huán);72℃延伸8min。小麥Actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為422bp。取等體積的PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色,紫外燈觀察照相。根據(jù)已克隆的小麥木聚糖酶基因序列,設(shè)計(jì)了一對(duì)簡(jiǎn)并引物X1:5’-CGAGAACGAGATGAAGTGGT-3’;X2:5’-GTG(CT)TGAG(GA)GAAGG(CG)(TC)ACG-3’。PCR擴(kuò)增條件同上,Tm為54℃,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為652bp。取等體積的PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色,紫外燈觀察照相。2結(jié)果與分析2.1不同濃度as-對(duì)木聚糖酶活性的影響由圖1可以看出,對(duì)3個(gè)部位而言,木聚糖酶活平均值大小順序?yàn)?籽粒>幼葉>幼根,不同部位酶活平均值間差異極顯著。隨著As(Ⅲ)濃度的升高,籽粒木聚糖酶活性呈先上升后下降的趨勢(shì),幼根和幼芽中木聚糖酶活性變化趨勢(shì)不明顯。從圖2可得,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),4個(gè)濃度As(Ⅲ)處理后,籽粒中木聚糖酶活性都呈先上升后下降的趨勢(shì),0.1mg/L和對(duì)照的酶活在60h和120h時(shí)都有兩個(gè)較高的點(diǎn),5mg/L則在72h和120h時(shí)有兩個(gè)高峰,25mg/L濃度在84h和144h有兩個(gè)低谷。對(duì)4個(gè)濃度酶活平均值來說,25mg/L濃度比對(duì)照低30.17%,和其他3個(gè)濃度的差異都達(dá)到顯著水平,說明25mg/LAs(Ⅲ)對(duì)籽粒木聚糖酶活性有較強(qiáng)的抑制作用。圖3顯示了隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),0.1、5、25mg/LAs(Ⅲ)處理后,幼根中木聚糖酶活性均呈先上升后下降趨勢(shì),且都在60h時(shí)出現(xiàn)高峰;對(duì)照則呈逐漸下降的趨勢(shì)。對(duì)4個(gè)濃度幼根酶活平均值而言,25mg/L>5mg/L>0mg/L>0.1mg/L,25mg/L濃度As(Ⅲ)處理后酶活平均比對(duì)照高1.02倍,與其它3個(gè)濃度的差異都達(dá)極顯著水平,說明25mg/LAs(Ⅲ)對(duì)幼根木聚糖酶活性有極大的促進(jìn)作用。圖4表明,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),4個(gè)濃度As(Ⅲ)處理后,幼葉中木聚糖酶活性都呈先上升后下降的趨勢(shì)。對(duì)4個(gè)濃度幼葉木聚糖酶活平均值而言,25mg/L>5mg/L>0mg/L>0.1mg/L,5、25mg/L平均值比對(duì)照高23.70%和35.24%,與對(duì)照差異達(dá)極顯著水平,說明隨著As(Ⅲ)濃度的升高,幼葉中木聚糖酶活性顯著升高。綜上所述,高濃度As(Ⅲ)對(duì)籽粒中木聚糖酶活性有抑制作用,對(duì)幼根和幼葉中木聚糖酶活性有促進(jìn)作用。從時(shí)間進(jìn)程上來看,幼根中木聚糖酶活最高點(diǎn)出現(xiàn)的要早于籽粒和幼葉。2.2as脅迫對(duì)小麥幼葉木聚糖酶基因表達(dá)的影響用半定量RT-PCR方法對(duì)小麥木聚糖酶基因表達(dá)動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析,結(jié)果表明,小麥Actin基因和木聚糖酶基因分別得到與預(yù)期片段大小一致的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。As(Ⅲ)處理后小麥葉片中Actin基因在不同取樣時(shí)間擴(kuò)增條帶亮度基本相同。以此為對(duì)照,分析了葉片中小麥木聚糖酶基因在不同As(Ⅲ)處理下不同時(shí)間的表達(dá)變化?；叶确治鼋Y(jié)果顯示,25mg/LAs(Ⅲ)脅迫下木聚糖酶基因在表達(dá)量上高于0、0.1、5mg/L,在表達(dá)時(shí)間上長(zhǎng)于0和0.1mg/L。4個(gè)濃度As(Ⅲ)脅迫下木聚糖酶基因表達(dá)強(qiáng)度依次為25mg/L>5mg/L>0mg/L>0.1mg/L,這和2.1中木聚糖酶活性的測(cè)定結(jié)果是一致的。圖5顯示,未加As(Ⅲ)處理的小麥幼葉的木聚糖酶基因在培養(yǎng)后132h開始有表達(dá),但是表達(dá)時(shí)間很短,只在第6～7天,第8天開始已不表達(dá)。圖6中,0.1mg/LAs(Ⅲ)處理后,小麥幼葉的木聚糖酶基因在培養(yǎng)后第5天開始就有表達(dá),但是從第7天開始已不表達(dá),在表達(dá)時(shí)間上早于對(duì)照,表達(dá)量上低于對(duì)照。圖7表明,5mg/LAs(Ⅲ)脅迫下幼葉木聚糖酶基因從培養(yǎng)第5天已開始表達(dá),持續(xù)至第7天后才開始下降,同一時(shí)間木聚糖酶基因在表達(dá)量上較對(duì)照低,表達(dá)時(shí)期上比0和0.1mg/L長(zhǎng)。圖8中,25mg/LAs(Ⅲ)脅迫下木聚糖酶基因也是從第5天開始表達(dá),延續(xù)至第7天仍很高,第8天時(shí)開始逐漸不表達(dá),25mg/LAs(Ⅲ)脅迫下小麥幼葉木聚糖酶基因在同一時(shí)間表達(dá)量上高于對(duì)照和其他兩個(gè)濃度的處理。3濃度as對(duì)葉中木聚糖酶基因表達(dá)的影響木聚糖酶作為一種半纖維素水解酶,它和α-淀粉酶一樣,在種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的過程中,分解胚乳營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供植物生長(zhǎng)所需的碳源及代謝中間產(chǎn)物。如本試驗(yàn)中4個(gè)濃度As(Ⅲ)處理后,籽粒中木聚糖酶活都有一個(gè)先上升后下降的趨勢(shì),由試驗(yàn)可得,小麥幼苗3個(gè)部位木聚糖酶活性大小順序?yàn)樽蚜?gt;幼葉>幼根,因?yàn)樽蚜Ｔ谛←溍劝l(fā)初期是主要的營(yíng)養(yǎng)源,呼吸代謝比較旺盛,相應(yīng)酶的活性也較高。25mg/LAs(Ⅲ)處理下幼根和幼葉中木聚糖酶活性顯著高于其他3個(gè)濃度,這一點(diǎn)從分子水平上可以加以驗(yàn)證。由不同取樣時(shí)間幼葉中木聚糖酶基因表達(dá)情況來看,隨著As(Ⅲ)濃度的升高,幼葉中木聚糖酶基因表達(dá)出現(xiàn)得早,結(jié)束的晚,在表達(dá)量上低濃度的As(Ⅲ)抑制木聚糖酶基因的表達(dá),當(dāng)As(Ⅲ)濃度≥25mg/L時(shí),木聚糖酶基因表達(dá)量高于對(duì)照,說明高濃度As(Ⅲ)對(duì)葉中木聚糖酶基因的表達(dá)有促進(jìn)作用。As(Ⅲ)如何影響木聚糖酶基因的表達(dá),這一點(diǎn)可以從以下兩方面進(jìn)行推測(cè):(1)植物的生長(zhǎng)發(fā)育受到各種酶的調(diào)節(jié),在種子萌發(fā)過程中,酶的形成有兩個(gè)來源,一是由已存在的蛋白質(zhì)釋放或激活;二是重新合成。籽粒中木聚糖酶可能屬于前者,即束縛態(tài)酶的釋放,在高濃度As(Ⅲ)脅迫下,小麥根部生長(zhǎng)受阻[18,19,20,18,19,20],籽粒不能很好的進(jìn)行吸脹吸水,相應(yīng)的呼吸代謝中間酶活性也下降;根和葉中木聚糖酶可能是重新合成的酶,高濃度的As(Ⅲ)通過影響木聚糖酶基因合成過程中的一些關(guān)鍵因子,使根和葉中木聚糖酶基因表達(dá)量增加,酶活性增高。(2)在小麥等禾本科植物種子萌發(fā)和幼苗形成過程中,糊粉層細(xì)胞合成并分泌水解酶到淀粉性胚乳中,給正在生長(zhǎng)的胚提供營(yíng)養(yǎng),一旦完成它們的分泌作用,糊粉層細(xì)胞立即死亡。分析大麥、小麥糊粉層與玉米花粉等來源木聚糖酶結(jié)構(gòu)特性發(fā)現(xiàn),它們擁有許多共同點(diǎn):它們具有高度同源性(41%),同屬于fami