RD區(qū)EspJ蛋白在結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞中的作用

劉麗莎鐘燕霄田晴劉敏潘勤章曉聯(lián)羅鳳玲(武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，湖北武漢430071)結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)感染引起的慢性傳染病，是單一傳染源的頭號(hào)死亡原因[1]。世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，2021年全球結(jié)核潛伏感染人群接近20億，新發(fā)病例987萬(wàn)[1]。近年來(lái)耐藥結(jié)核病以及人類(lèi)免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)和M.tb共感染患者的增多，給我國(guó)結(jié)核病防治工作帶來(lái)了更大的挑戰(zhàn)[2]。同時(shí)，卡介苗(bacillusCalmette-Guérin,BCG)作為當(dāng)前廣泛使用的抗結(jié)核疫苗，保護(hù)效力存在不足[3]。因此，進(jìn)一步探索M.tb逃逸免疫殺傷的機(jī)制對(duì)于結(jié)核病的研究、診斷和治療具有重要意義。1998年，英國(guó)Sanger中心和法國(guó)Pasteur研究所聯(lián)合報(bào)告了M.tbH37Rv全基因組序列圖[4]。通過(guò)全基因組比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與M.tbH37Rv或牛分枝桿菌相比，BCG基因組有一部分缺失片段，被稱為M.tb的差異區(qū)域(regionofdifference,RD)，通稱為RD區(qū)。RD區(qū)共有16個(gè)區(qū)域，可編碼129種蛋白質(zhì)，與M.tb的毒力密切相關(guān)[5]。目前對(duì)RD-1區(qū)的研究較多，RD-1區(qū)蛋白參與了M.tb感染后宿主細(xì)胞膜的破壞、免疫逃逸等諸多過(guò)程[6]。因此，研究RD區(qū)蛋白在結(jié)核病免疫中的作用具有重要意義。研究表明，在M.tb感染的過(guò)程中，Ⅰ型干擾素(interferon，IFN)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而破壞機(jī)體對(duì)M.tb的免疫反應(yīng)，有利于M.tb在細(xì)胞內(nèi)的存活[7]。M.tb的強(qiáng)毒力會(huì)使白細(xì)胞介素-12(interleukin-12，IL-12)依賴型Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)降低，從而誘導(dǎo)更高水平的Ⅰ型IFN[8-9]。M.tb的毒力主要是由毒力因子ESAT-6分泌系統(tǒng)1(ESAT-6secretionsystem1,ESX-1)相關(guān)蛋白決定[10]。ESX-1基因簇位于RD-1區(qū)，參與M.tb宿主逃逸，對(duì)M.tb至關(guān)重要。EspJ是由Rv3878編碼的蛋白，屬于ESX-1分泌相關(guān)蛋白，目前EspJ在M.tb感染過(guò)程中的具體功能尚不清楚。本研究擬通過(guò)Rv3878基因原核表達(dá)載體，構(gòu)建表達(dá)EspJ的重組恥垢分枝桿菌(MycolicibacteriumSmegmatis,M.s)及重組BCG，探究Rv3878基因編碼的EspJ蛋白在結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞中的作用，以期進(jìn)一步闡明EspJ的生物學(xué)功能，為結(jié)核病診治及新型疫苗研發(fā)提供理論依據(jù)。1材料及方法1.1菌株和質(zhì)粒M.tb標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv[strainATCC(美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù))25618]和M.s菌株[strainATCC70084]由武漢大學(xué)ABSL-Ⅲ實(shí)驗(yàn)室提供，并由本實(shí)驗(yàn)室凍存。BCG、大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)DH5α(strainATCC25922)、E.coliBL-21(strainATCCBAA-1025)由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存。pMV261、pMV361及pGEX-KG質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。1.2細(xì)胞和動(dòng)物RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存。BALB/c小鼠，6～8周齡，雌性，購(gòu)自湖北省疾控中心。本研究已通過(guò)我校倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào)：18021B)。1.3主要試劑1.3.1細(xì)菌培養(yǎng)Middlebrook7H9、Middlebrook7H11及MiddlebrookOADC購(gòu)自BD公司；基因組提取試劑盒與溶菌酶購(gòu)自TIANGEN公司；ProteinaseK購(gòu)自Roche公司。1.3.2PCR、RT-qPCR及酶切鑒定質(zhì)粒提取和瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購(gòu)自O(shè)mega公司；PhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase購(gòu)自Vazyme公司；EcoRⅠ、HindⅢ購(gòu)自Promega公司；DNALigationHighKit購(gòu)自TOYOBO公司。PCR和RT-qPCR引物、DNAmarker均在武漢擎科生物技術(shù)有限公司訂購(gòu)。1.3.3蛋白提取及多克隆抗體制備異丙基硫代半乳糖苷(isopropylbeta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；GST-Sephagarose4B購(gòu)自GE公司。弗氏佐劑購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；ELISA包被液、TMB顯色液購(gòu)自Biolegend公司。1.3.4蛋白刺激細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自Natocor公司；polymyxinB購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；小鼠巨噬細(xì)胞集落刺激因子購(gòu)自PeproTech公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreen均購(gòu)自TOYOBO公司；TritonX100購(gòu)自Amresco公司；MouseIFN-βΕLISAKit購(gòu)自武漢華聯(lián)科公司。1.3.5WesternBlot十二烷基磺酸鈉(sodiumdodecylsulfate,SDS)、過(guò)硫酸銨、吐溫-20及無(wú)水甲醇購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚丙烯酰胺購(gòu)自Biosharp公司；TEMED購(gòu)自谷歌生物公司；TrisBase、甘氨酸購(gòu)自Amresco公司；Marker購(gòu)自Bio-Rad公司；羊抗鼠IgG-HRP購(gòu)自ABclonal公司；β-actin單抗購(gòu)自AffinityBioscience公司；ECL顯色底物購(gòu)自雅酶公司。1.4方法1.4.1PCR1.4.2原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建Rv3878PCR產(chǎn)物和原核表達(dá)載體pGEX-KG分別經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ酶切后，用DNA連接酶連接得到pGEX-KG-Rv3878，轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落培養(yǎng)。提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并送武漢擎科生物科技有限公司進(jìn)行DNA基因測(cè)序。1.4.3重組蛋白的誘導(dǎo)提取及純化將pGEX-KG-Rv3878轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落接種于液體培養(yǎng)基(含氨芐霉素)，37℃、200r/min培養(yǎng)至菌液吸光度值達(dá)0.6～0.8，加入IPTG，25℃、150r/min培養(yǎng)16h，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。碎菌后經(jīng)高速離心，留取上清和沉淀，并將轉(zhuǎn)化pGEX-KG的E.coliBL21和未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌作為對(duì)照。上清中加GST-Sephagarosebeads于4℃混勻儀孵育2h。收集柱子后用PBS洗3遍，用Tris-HCL-還原型谷胱甘肽-Elutionbuffer于混勻儀4℃，30min洗脫，得到GST-EspJ并進(jìn)行鑒定。1.4.4小鼠多克隆抗體的制備取4只6～8周齡雌性BalB/c小鼠，剪尾取100～200μL血清作為免疫前血清對(duì)照。針對(duì)每只小鼠，取同體積的100～200μg蛋白與弗氏完全佐劑混合乳化，通過(guò)腹腔注射免疫小鼠。每隔7～10天，取同體積的50～100μg蛋白與不完全佐劑混合超聲乳化后腹腔注射免疫，共免疫4～5次。眼球取血后可獲得多克隆抗體血清，置于-20℃保存。1.4.5ELISA每孔加100μL混合的1～2μgEspJ與ELISA包被液，4℃過(guò)夜。PBST洗3次，拍干后每孔加250μL2%BSA置于37℃孵育1h。PBST洗3次，每孔加200μL倍比稀釋的多抗血清(1∶200～1∶409600)作為一抗，保留一孔作為空白對(duì)照，置于37℃孵育1h。PBST洗5次，每孔加200μLIgG-HRP，置于37℃孵育1h。PBST洗5次，每孔加顯色液A、B液各50μL，避光置于37℃孵育10～15min，每孔加50μL硫酸終止。測(cè)450nm波長(zhǎng)處的吸光度(opticaldensity，OD450)，計(jì)算效價(jià)。1.4.6重組蛋白GST-EspJ刺激小鼠巨噬細(xì)胞將RAW264.7細(xì)胞和小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞(bonemarrow-derivedmacrophage，BMDM)接種于六孔板，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%～80%，加入5μg/mL和10μg/mL已去除內(nèi)毒素的GST和GST-EspJ，分別刺激1h、3h、6h、12h。收取細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)INF-βmRNA表達(dá)水平，ELISA和Westernblot檢測(cè)IFN-β的含量及變化。1.4.7Westernblot將蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，并將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜放入5%脫脂奶粉封閉液中室溫封閉1h，用TBS-吐溫20[0.5%](TBST)洗滌，加入一抗抗體溶液，4℃孵育過(guò)夜。TBST洗3次，加入羊抗鼠或兔IgG-HRP，室溫孵育1h。TBST洗3次，滴加顯色液后在ECL化學(xué)發(fā)光儀中顯色。1.4.8RT-qPCR提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后得到互補(bǔ)DNA(complementaryDNA,cDNA)，于-20℃儲(chǔ)存。RT-qPCR引物序列：鼠IFN-β引物序列為5’-ATGAGTGGTGGTTG-CAGGC-3’(F)和5’-TGACCTTTCAAATGCAGTAGATT-3’(R)；鼠GAPDH引物序列為5’-CATCACTGCCACCCAGAAGACTG-3’(F)和5’-ATGCCAGTGAG-CTTCCCGTTCAG-3’(R)；鼠IL-10引物序列為5’-AGTGGAGCAGGTGAAG-AGTG-3’(F)和5’-TTCGGAGAGAGGTACAAACG-3’(R)；鼠IL-1β引物序列為5’-CCCAACTGGTACATCAGCAC-3’(F)和5’-TCTGCTCATTCACGAAA-AGG-3’(R)。RT-qPCR反應(yīng)體系(20μL)：2×SYBRGREEN10μL，引物(F+R)1μL，ddH2O8μL，cDNA1μL。RT-qPCR程序：Holdingstage：95℃1min，cyclestage:95℃15s，退火58℃20s，延伸72℃20s并收集熒光信號(hào)，共40個(gè)循環(huán)。1.4.9重組恥垢分枝桿菌(rM.s::Rv3878)和重組BCG(rBCG::Rv3878)的構(gòu)建將Rv3878構(gòu)建至pMV261和pMV361穿梭載體。在M.s感受態(tài)細(xì)胞中分別電轉(zhuǎn)化1～5μgpMV261-Rv3878和pMV261，在BCG感受態(tài)細(xì)胞中分別電轉(zhuǎn)化2～5μgpMV361-Rv3878和pMV361。用卡那霉素抗性的固體培養(yǎng)基分別篩選3天和4周，選擇單菌落作為rM.s::Rv3878和rBCG::Rv3878，并進(jìn)行PCR及WesternBlot鑒定。1.4.10重組菌株刺激小鼠巨噬細(xì)胞將RAW264.7和BMDM細(xì)胞接種于六孔板，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%～80%，加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的M.s、rM.s::Rv3878、BCG、rBCG::Rv3878(MOI=10∶1)感染細(xì)胞1h后洗去，加入培養(yǎng)基分別培養(yǎng)至3h、6h、12h后收取細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)IFN-β、IL-1β、IL-10mRNA表達(dá)水平。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法各實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，通過(guò)SPSS26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用means±SEM表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1Rv3878的原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定提取M.tbH37Rv全基因組，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到Rv3878基因(圖1A)。將Rv3878構(gòu)建至原核表達(dá)載體pGEX-KG，經(jīng)轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定(圖1B)及DNA基因測(cè)序。酶切結(jié)果表明，單克隆1、3號(hào)構(gòu)建成功。DNA基因測(cè)序結(jié)果顯示其與Rv3878基因序列相符。原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG-Rv3878構(gòu)建成功。注：A：Rv3878的PCR擴(kuò)增；B：pGEX-KG-Rv3878的EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定。M：DL2000DNAmarker圖1Rv3878的原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定2.2重組蛋白GST-EspJ的表達(dá)及純化將pGEX-KG-Rv3878轉(zhuǎn)化到E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落培養(yǎng)，加IPTG誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)效果在25℃時(shí)最佳。誘導(dǎo)蛋白表達(dá)12h后，提取純化重組蛋白，進(jìn)行SDS分析鑒定(圖2)。結(jié)果顯示在54kD處有明顯條帶，表明成功獲得GST-EspJ，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖2GST-EspJ的表達(dá)及純化2.3抗EspJ蛋白鼠多克隆抗體的制備及效價(jià)檢測(cè)用GST-EspJ免疫雌性BALB/c小鼠后收取血清，ELISA測(cè)定多克隆抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，經(jīng)GST-EspJ免疫的小鼠能產(chǎn)生針對(duì)EspJ的特異性抗體。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了稀釋濃度，取血清倍比稀釋后檢測(cè)血清OD450。結(jié)果顯示，隨著稀釋倍數(shù)的增加，其OD450隨之下降。免疫后血清OD450/免疫前血清OD450≥2.1時(shí)的稀釋濃度即為效價(jià)，經(jīng)計(jì)算效價(jià)為1∶204800(圖3)。圖3抗EspJ蛋白鼠多克隆抗體的效價(jià)檢測(cè)2.4抗EspJ蛋白鼠血清多克隆抗體特異性驗(yàn)證以GST-EspJ為抗原，多克隆抗體血清為一抗，羊抗鼠IgG-HRP為二抗，WesternBlot檢測(cè)多克隆抗體的特異性。結(jié)果顯示，在54kD處有特異性條帶，表明該抗體可特異性識(shí)別EspJ(圖4)。注：M：marker；1～4：分別為1～4號(hào)GST-EspJ蛋白免疫小鼠多克隆抗體圖4Westernblot驗(yàn)證抗EspJ蛋白鼠多克隆抗體的特異性2.5GST-EspJ蛋白對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞Ⅰ型干擾素的影響用不同劑量的GST-EspJ刺激RAW264.7細(xì)胞，以及相同劑量GST-EspJ刺激巨噬細(xì)胞不同時(shí)長(zhǎng)，RT-qPCR檢測(cè)IFN-βmRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，GST-EspJ處理后小鼠巨噬細(xì)胞中INF-βmRNA表達(dá)水平明顯升高，在6h達(dá)到峰值，且隨著蛋白刺激濃度的增加而升高(圖5A和5B)。隨后以10μg/mLGST-EspJ刺激RAW264.7細(xì)胞，ELISA和Westernblot檢測(cè)細(xì)胞IFN-β的含量變化，發(fā)現(xiàn)INF-β表達(dá)水平顯著升高，在12h達(dá)到峰值(圖5C和5D)。以上結(jié)果證明EspJ蛋白可以促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞中Ⅰ型IFN的產(chǎn)生。注：A和B分別為5μg/mL和10μg/mLGST及GST-EspJ刺激RAW264.7細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)IFN-βmRNA表達(dá)水平；C和D為10μg/mLGST及GST-EspJ刺激RAW264.7細(xì)胞，ELISA和Westernblot檢測(cè)細(xì)胞裂解液中IFN-β的含量及表達(dá)水平；*P<0.05，**P<0.01，***P2.6成功構(gòu)建表達(dá)Rv3878基因的rM.s::Rv3878和rBCG::Rv3878將Rv3878基因構(gòu)建至pMV261、pMV361穿梭載體，酶切鑒定結(jié)果顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖6A和6B)。將重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化至M.s和BCG中，獲得rM.s::Rv3878和rBCG::Rv3878，并進(jìn)行PCR鑒定(圖6C和6D)及WesternBlot鑒定(圖6E)。結(jié)果顯示，菌液PCR產(chǎn)物與Rv3878基因長(zhǎng)度相同，rBCG::Rv3878菌株包含Rv3878，并且可表達(dá)EspJ。以上結(jié)果表明rM.s::Rv3878、rBCG::Rv3878構(gòu)建成功。注：A：pMV261-Rv3878的酶切鑒定；B：pMV361-Rv3878的酶切鑒定；C：rM.s::Rv3878的PCR鑒定；D：rBCG::Rv3878的PCR鑒定；E：rBCG::Rv3878蛋白表達(dá)驗(yàn)證圖6表達(dá)M.tbRv3878基因的rM.s::Rv3878和rBCG::Rv3878構(gòu)建和鑒定2.7rM.s::Rv3878和rBCG::Rv3878感染巨噬細(xì)胞后可促進(jìn)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的rMs::Rv3878和rBCG::Rv3878感染RAW264.7和BMDM細(xì)胞3h、6h和12h(MOI=10∶1)，同時(shí)以空載菌株作為陰性對(duì)照，RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞IFN-β、IL-1β、IL-10等細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，rMs::Rv3878和rBCG::Rv3878可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞中IFN-β的產(chǎn)生(圖7A和7B)。此外，rBCG::Rv3878感染BMDM細(xì)胞后還可促進(jìn)IL-1β和IL-10的表達(dá)(圖7C和7D)。注：A：rM.s::Rv3878以MOI=10∶1感染RAW264.7細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)IFN-βmRNA表達(dá)水平；B～D：rBCG::Rv3878以MOI=10∶1感染BMDM細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)IFN-β、IL-1β、IL-10mRNA表達(dá)水平；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P3討論結(jié)核病是一種慢性傳染病，可分為活動(dòng)性結(jié)核病和潛伏性結(jié)核病，約5%～10%的潛伏感染個(gè)體發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病[1]。在中國(guó)，結(jié)核病仍然是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生威脅。結(jié)核病的早期診斷以及有效的疫苗研發(fā)對(duì)于結(jié)核病防控至關(guān)重要。因此，需要進(jìn)一步研究M.tb感染及免疫逃逸的機(jī)制，尋找新的生物標(biāo)志物和藥物及疫苗新靶點(diǎn)。RD區(qū)與M.tb的毒力密切相關(guān)，有多個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)抗原，一直是M.tb感染機(jī)制研究及新疫苗研發(fā)熱點(diǎn)。關(guān)于RD-1區(qū)的研究較多，RD-1區(qū)全長(zhǎng)9.5kb，包含9個(gè)閱讀框，即Rv3871～Rv3879c。RD-1區(qū)是M.tb的主要毒力因子，參與了M.tb感染、免疫逃逸等致病過(guò)程[11]。如培養(yǎng)濾液蛋白10(culturefiltrateprotein-10，CFP-10)和ESAT-6是兩種免疫優(yōu)勢(shì)RD-1區(qū)蛋白，可形成毒力決定簇激活免疫應(yīng)答，參與結(jié)核病發(fā)病過(guò)程[12]。ESAT6分子量低且免疫原性高，在結(jié)核病診斷和亞單位疫苗開(kāi)發(fā)方面有重要價(jià)值[13]?，F(xiàn)已有研究嘗試將部分RD-1區(qū)基因?qū)隑CG構(gòu)建重組菌株，可增強(qiáng)疫苗保護(hù)性[14]。PE35(Rv3872)、PPE68(Rv3873)蛋白可使巨噬細(xì)胞IL-10增加及IL-12降低，參與M.tb的免疫逃逸過(guò)程[15]；二者相互作用時(shí)結(jié)構(gòu)由無(wú)序向有序轉(zhuǎn)變，使M.tb毒力增強(qiáng)[16]。高毒力M.tb感染巨噬細(xì)胞時(shí)會(huì)誘導(dǎo)高水平Ⅰ型IFN的產(chǎn)生。在M.tb感染中，高濃度的Ⅰ型IFN會(huì)通過(guò)促進(jìn)免疫抑制分子的產(chǎn)生和降低巨噬細(xì)胞對(duì)IFN-γ激活的反應(yīng)等，使細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)存活，加重對(duì)宿主