大豆根腐病尖孢鐮刀菌的分離篩選及生物活性測定

0尖孢鐮菌毒種大豆根腐病是黑龍江省大豆最重要的疾病之一。在市場經(jīng)濟(jì)的驅(qū)動(dòng)下，大豆的重農(nóng)和重農(nóng)現(xiàn)象日益嚴(yán)重，根腐病的危害更加嚴(yán)重，嚴(yán)重影響了大豆的穩(wěn)定和高產(chǎn)。尖孢鐮刀菌是該病的主要致病菌。關(guān)于該病菌毒素的提取、定性、活性分析國外很少有報(bào)道,國內(nèi)未見報(bào)道。為此,本文對(duì)該病菌毒素進(jìn)行了初步研究,為今后明確其致病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1細(xì)菌的分離供試F.oxysporum菌株采自八五○農(nóng)場、海倫、巴彥等地大豆根腐病株。按常規(guī)組織分離法獲得純化的菌株,并進(jìn)行了致病性測定。1.2培養(yǎng)液的制備菌株移接在PSA平板培養(yǎng)基上,于25℃下培養(yǎng)7d,沿菌落邊緣打出直徑為8mm菌片,接入裝有100mL培養(yǎng)液的250mL三角瓶內(nèi),每瓶接4片,置所需條件培養(yǎng)。培養(yǎng)液經(jīng)過濾,(先用4層紗布,再用2層濾紙),濾液離心30min(3000r/min),棄去沉淀,上清液煮沸15min,濾液保存在4℃冰箱內(nèi),供測試用。取PSC和Richard培養(yǎng)濾液經(jīng)高溫處理(121℃)20min。1.3提取毒素1.3.1性炭的預(yù)處理將菌株接種在PSA培養(yǎng)液中,置25~28℃,培養(yǎng)15d后,過濾。于培養(yǎng)液中加5%的活性炭置于5~6℃冰箱內(nèi),過夜后,用濾紙過濾炭末,然后將炭末浸泡于10倍體積的熱甲醇中,去除不溶物。濃縮淡黃色甲醇提取液至褐色,再將濃縮物溶于50mL熱甲醇中,移出不溶物。上清液加3倍體積的氯仿沉淀,移出黃色不溶物,剩下甲醇-氯仿溶解液蒸發(fā)至干,即獲得粗毒素。1.3.2從有機(jī)溶劑中提取將培養(yǎng)濾液,用乙酸乙酯萃取3次(每100mL培養(yǎng)濾液用35mL乙酸乙酯),然后將萃取液濃縮,得到淡黃色粗提取物。1.4毒素的生物活性測定1.4.1生長抑制率測定供試材料:大豆墾農(nóng)4號(hào)。測定方法:參照陸仕華(1985)抑制胚根生長測定法。將供試的大豆種子用清水洗凈,用漂白粉溶液(1︰14)浸種10min,進(jìn)行表面消毒。用無菌水沖洗3遍后加水置25℃黑暗下培養(yǎng),48h后測定并計(jì)算胚根生長抑制率。每處理30粒種子,3次重復(fù)。1.4.2植株反應(yīng)級(jí)別取一出復(fù)葉剛展開的大豆幼苗,根系洗凈后切去一小段根,浸入裝有毒素溶液的試管中,毒素液內(nèi)含有少許鏈霉素,防止細(xì)菌污染。觀察萎蔫情況。植株反應(yīng)級(jí)別分為無反應(yīng)、輕度反應(yīng)、中度反應(yīng)和重度反應(yīng),按下面所述標(biāo)準(zhǔn)鑒別。無反應(yīng):植株正常,葉片無萎蔫;輕度反應(yīng):真葉下垂或卷曲,復(fù)葉正常;中度反應(yīng):真葉、復(fù)葉卷曲,重度反應(yīng):整個(gè)葉片卷曲至枯死。1.5主要毒素轉(zhuǎn)化性能測定1.5.1種子萌發(fā)試驗(yàn)供試作物:大豆、綠豆、黃瓜。參照孫順娣(1994)的種子萌發(fā)抑制法。選擇大小一致飽滿的種子,經(jīng)消毒后,在50℃溫水中浸種15min,轉(zhuǎn)入裝有不同濃度毒素液的小燒杯內(nèi)浸泡,種子浸泡24h后取出,用無菌水沖洗3次,放入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中,皿內(nèi)另有3mL粗毒素液,置于25℃恒溫箱內(nèi),3d后調(diào)查種子發(fā)芽率,胚根長超過種子直徑記為萌發(fā)。每處理30粒種子,3次重復(fù)。1.5.2毒素對(duì)不同作物種子萌發(fā)的影響供試作物:大豆、綠豆、茄子、番茄、黃瓜、辣椒。測定方法:同1.4.1。2結(jié)果與分析2.1fhm1的生長與產(chǎn)毒量供試菌株中,菌株F8503的產(chǎn)毒量最高,其胚根生長抑制率為75.1%,其次是菌株FBM1,胚根生長抑制率為43.1%,菌株FHM1的產(chǎn)毒量最低,抑制率為23.3%(見表1)。2.2毒素的變化測定結(jié)果見表2。從表2可以看出,尖孢鐮刀菌毒素經(jīng)121℃高溫高壓處理20min后,其毒性幾乎沒有變化。說明大豆根腐病菌(F.oxysporum)毒素有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。2.3乙酸乙酯萃取法與炭吸附法提取毒素量的比較通過兩種不同方法提取毒素的比較,結(jié)果表明,用炭吸附法提取的毒素量多于乙酸乙酯萃取法提取的毒素量。二者差異極顯著(表3)。以下試驗(yàn)采用炭吸附法提取毒素。2.4毒素的生物活性測定2.4.1毒素的影響對(duì)毒素的不同濃度及毒素提取過程中的沉淀物進(jìn)行了測定,結(jié)果表明(表4),毒素對(duì)大豆胚根生長有明顯的抑制作用,毒素濃度越高,抑制作用越強(qiáng);而沉淀物對(duì)胚根生長的影響不大,沉淀物中含有何物質(zhì)有待于進(jìn)一步研究。2.4.2大豆植株真葉試驗(yàn)不同的處理對(duì)大豆幼苗的致萎作用不同。結(jié)果見表5,處理24h,100%和50%的毒素液使大豆植株的真葉下垂,葉緣輕微卷曲,復(fù)葉正常;處理48h后,100%毒素液中大豆真葉、一出復(fù)葉都卷曲;72h后,100%毒素液中的植株枯死,50%毒素液中大豆真葉、復(fù)葉萎蔫。對(duì)照及其它處理植株正常。2.5粗毒素對(duì)作物種子萌發(fā)的影響試驗(yàn)結(jié)果表明引起大豆根腐病的尖孢鐮刀菌毒素對(duì)不同作物種子的萌發(fā)均有不同程度的抑制作用。經(jīng)不同毒素濃度處理的種子萌發(fā)率均下降,其中對(duì)大豆種子萌發(fā)抑制作用最強(qiáng)。100%粗毒素原液處理,大豆種子萌發(fā)率只有19.2%,抑制率為80.1%(表6)。試驗(yàn)結(jié)果還表明隨著毒素濃度的升高,對(duì)作物種子的萌發(fā)抑制率增強(qiáng)。毒素不僅對(duì)不同作物種子萌發(fā)有抑制作用,而且對(duì)不同作物胚根生長也有抑制作用(表7)。毒素對(duì)5種作物的胚根生長均有明顯的抑制作用,在100%毒素濃度下,對(duì)綠豆的胚根生長抑制率最大,為89.9%,對(duì)辣椒的胚根生長抑制率最小,為77.1%。當(dāng)毒素濃度為25%時(shí),對(duì)供試作物胚根仍有很強(qiáng)的抑制作用。由表6、表7說明該毒素為非專化性毒素。3大豆根腐病菌毒素檢測3.1病菌產(chǎn)毒量的多少與不同的菌株有關(guān),已有的禾谷鐮刀菌菌株引起棉花枯萎病的尖孢鐮刀菌的研究表明3菌株間產(chǎn)毒量的差異,本研究采用尖孢鐮刀菌4個(gè)不同菌株,結(jié)果與之相同,4個(gè)菌株的產(chǎn)毒量不同。另外,病菌的毒素濾液經(jīng)高溫處理后,毒素活性幾乎沒有改變,說明該毒素比較穩(wěn)定。3.2M.L.Sutherl等(1995)將尖孢鐮刀菌(Fusoriumoxysporumf.p.lycopersiciracel)培養(yǎng)濾液經(jīng)硫酸銨沉淀,再經(jīng)SephadexG25層析柱分離得到純毒素,測定為蛋白質(zhì)。而引起大豆根腐病的尖孢鐮刀菌(Fusoriumoxysporum)毒素濾液經(jīng)過高溫后,毒素活性并沒有改變,說明該毒素不是糖蛋白,故本試驗(yàn)用碳吸附法和萃取法提取毒素,結(jié)果用炭吸附法提取的毒素量多于乙