基于rapd標(biāo)記的蘇鐵屬21個(gè)種類的親緣關(guān)系研究

目前，已有90多種植物（包括亞洲、大西洋和非洲）被報(bào)道，并分布在世界上。對(duì)整個(gè)蘇鐵植物的系統(tǒng)發(fā)展關(guān)系、現(xiàn)有蘇鐵植物的起源和遷移特征以及環(huán)境適應(yīng)機(jī)制具有重要意義（黃玉源，2001）。此外,蘇鐵植物為重要的園林與園藝觀賞性植物,在園林造景、城市綠化、公園珍稀植物觀賞園的構(gòu)建、城市生態(tài)環(huán)境的改善等方面發(fā)揮重要作用。近幾十年來,科研工作者對(duì)蘇鐵屬植物進(jìn)行了大量的野外調(diào)查研究,陸續(xù)發(fā)表了一些新種。但是,關(guān)于蘇鐵屬下種間的親緣演化關(guān)系、分類位置還未完全弄清,有的種是否成立還存在一些爭(zhēng)議,分子水平上的分類學(xué)研究還較少,尤其是用于進(jìn)行種間及種下各分類等級(jí)劃分的分子生物學(xué)方法的報(bào)道還極少。只有少數(shù)學(xué)者利用同工酶(王發(fā)祥等,1996)、DNA片段測(cè)序(Hill,2003)、ISSR分子標(biāo)記(馬永,2005;Xiao&Gong,2006)對(duì)蘇鐵屬的系統(tǒng)與分類進(jìn)行了研究。RAPD標(biāo)記有其它分子標(biāo)記無法比擬的優(yōu)勢(shì),如技術(shù)成熟、簡(jiǎn)便易行、使用成本低,無需專門設(shè)計(jì)RAPD擴(kuò)增反應(yīng)引物,也無須預(yù)先知道被研究生物基因組的核苷酸序列,RAPD分析所需的DNA樣品量極少等,因而被廣泛應(yīng)用于生物系統(tǒng)學(xué)的研究中,如在蕓苔屬(Demeke等,1992)、花生屬(Halward等,1992)、小麥屬(Joshi等,1993)、大麥屬(Gonzalez等,1993)及蔥屬(Wilkie等,1993)的親緣關(guān)系研究中,以RAPD為標(biāo)記獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與經(jīng)典分類結(jié)果非常吻合。然而,除了黃玉源等(2009)利用RAPD分子標(biāo)記對(duì)蘇鐵屬的少數(shù)幾個(gè)種親緣關(guān)系進(jìn)行了探討外,RAPD分子標(biāo)記還少見應(yīng)用于蘇鐵屬的親緣關(guān)系與分類研究中。本研究利用RAPD標(biāo)記,對(duì)蘇鐵屬在親緣關(guān)系及分類上有爭(zhēng)議的21個(gè)種類(Chen等,1999;王定躍,2000;黃玉源,2001;Whitelock,2002;Hill,2003)進(jìn)行分析,旨在從DNA分子水平上探明它們之間的親緣關(guān)系和分類地位,以便為它們的保護(hù)利用提供合理的建議。1材料和方法1.1dna的提取供試的蘇鐵屬植物材料基本情況見表1,所有種類均為采自同一個(gè)種群10～15株的樣本,葉子采集后馬上用硅膠干燥(鄒喻蘋等,2001)。不能立即提取DNA的樣品放入-70℃冰箱中保存。主要試劑均購(gòu)買自國(guó)內(nèi)外各有資質(zhì)的廠家。1.2rapd反應(yīng)程序采用CTAB法((Doyle等,1987)提取總DNA,用1.0%(W/V)的瓊脂糖凝膠對(duì)各樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離檢測(cè)。RAPD的反應(yīng)體系為:20μL反應(yīng)體積,含純水9.04μL,10×Taqbuffer2.0μL,25mmol/LMg2+1.6μL,2.5mmol/LdNTP1.6μL,10μmol/L引物0.6μL,5U/μLTaq聚合酶0.2μL,10ng/μL摸板DNA5μL。RAPD擴(kuò)增PCR反應(yīng)程序的設(shè)定為:預(yù)變性94℃5min,變性94℃30s,退火37℃40s,延伸72℃110s,35個(gè)循環(huán),最后延伸7min,4℃保存。整個(gè)反應(yīng)過程持續(xù)時(shí)間約2h40min。用121個(gè)隨機(jī)引物分別擴(kuò)增形態(tài)上差異較大的3個(gè)種類,篩選出21個(gè)擴(kuò)增帶清晰且多態(tài)性豐富的引物,用于22個(gè)供試材料的進(jìn)一步分析。用NTSYS(V.2.10e)分析軟件,采用Jaccard相似系數(shù)(JaccardSimilaritycoefficient)對(duì)22個(gè)供試材料RAPD產(chǎn)物原始數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算,得到相似矩陣。然后用非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均聚類方法(Unweightedpairgroupmethodusingarithmeticaverage,UPGMA)對(duì)其進(jìn)行聚類分析,構(gòu)建蘇鐵屬植物的分子系統(tǒng)與聚類圖。2結(jié)果與分析2.1rapd擴(kuò)增帶分析首先用121個(gè)隨機(jī)引物分別擴(kuò)增形態(tài)上差異較大的3個(gè)種類,篩選出21個(gè)擴(kuò)增帶清晰且多態(tài)性豐富的引物(表2)。用于22個(gè)供試材料的進(jìn)一步分析。圖1為引物S22對(duì)22個(gè)供試材料的擴(kuò)增結(jié)果。21個(gè)引物共擴(kuò)增出333條DNA帶,各條引物擴(kuò)增的DNA帶在7～25條之間,平均每個(gè)引物擴(kuò)增出15.85條帶。擴(kuò)增的條帶在200～3000bp之間,其中多態(tài)性條帶313條,多態(tài)性位點(diǎn)比率為93.99%。表明蘇鐵各種間的遺傳基礎(chǔ)相當(dāng)復(fù)雜,多態(tài)性高,在DNA分子水平有非常大的差異。RAPD擴(kuò)增帶的有無記為1與0。在NTSYS(V.2.10e)軟件中進(jìn)行分析,遺傳相似系數(shù)采用Jaccard系數(shù)法,各個(gè)種類之間的相似系數(shù)見表3,最后用非加權(quán)算術(shù)平均聚類法(UPGMA)進(jìn)行聚類得到系統(tǒng)樹(圖2)。2.2蘇鐵屬常見群的組成和相似系數(shù)相似系數(shù)越大,兩個(gè)分類群的親緣關(guān)系越近,反之,親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。從表3可以看出,不同性別的滇南蘇鐵相似系數(shù)最大,為0.9098。各種間的遺傳相似系數(shù)在0.2903～0.7016之間,各種間的遺傳相似系數(shù)跨越的幅度較大,說明蘇鐵屬內(nèi)的遺傳背景十分復(fù)雜。多裂蘇鐵與叉孢蘇鐵的遺傳相似系數(shù)最大,為0.7016,在所有供試種類中,它們之間的親緣關(guān)系最近。隆林蘇鐵與多羽叉葉蘇鐵的遺傳相似系數(shù)最小,為0.2903,在所有供試種類中,它們之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。以上各類群的劃分,基本符合蘇鐵屬經(jīng)典分類的結(jié)果。此外,聚類的結(jié)果顯示出:絕大部分分布地理位置相對(duì)較近的種類,由于與環(huán)境適應(yīng)上有趨同演化的特點(diǎn),遺傳差異較小,聚類時(shí)先聚在一起,如尖尾蘇鐵(分布于廣西)與長(zhǎng)球果蘇鐵(分布于廣西)、滇南蘇鐵(分布于云南)與元江蘇鐵(分布于云南)等。3討論3.1rapd和issr標(biāo)記聚類與遺傳多樣性的關(guān)系以往采用RAPD方法對(duì)蘇鐵屬植物進(jìn)行種間關(guān)系(含種下分類等級(jí))的研究報(bào)道還極少,僅有黃玉源等(2009)用來探討蘇鐵屬下的幾個(gè)種的親緣關(guān)系,雖然RAPD標(biāo)記相比于ISSR標(biāo)記,是被研究運(yùn)用得較早的標(biāo)記,但研究證明其不失為一種好的標(biāo)記。許多利用RAPD和ISSR標(biāo)記對(duì)同樣材料的比較研究結(jié)果證明,兩種標(biāo)記的結(jié)果具有非常高的一致性;兩者的相關(guān)系數(shù)達(dá)到極顯著水平。例如:對(duì)黃麻屬的同樣材料,25個(gè)RAPD和ISSR引物分別擴(kuò)增出329條和283條帶,多態(tài)比率分別為89.36%和92.5%,雖然ISSR檢測(cè)出種間遺傳多樣性的分辨率比RAPD稍高,但兩者GS相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.955,即兩方法的結(jié)果有非常好的一致性(祁建民等,2004)。陳學(xué)軍等(2007)認(rèn)為,與RAPD相比,ISSR標(biāo)記檢測(cè)到的有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon多樣性指數(shù)(I)、遺傳離散度(Ht)和遺傳分化系數(shù)(Gst)等遺傳多樣性參數(shù)都較大,因而有更高的多態(tài)性檢測(cè)效率,但從實(shí)際的數(shù)據(jù)看,兩者數(shù)值相差很小,僅在0.01～0.04之間,而且相當(dāng)一部分的參數(shù)值是RAPD高于ISSR。因此,統(tǒng)計(jì)分析后得出結(jié)論:基于RAPD、ISSR的聚類與基于表型數(shù)據(jù)的聚類之間存在極顯著的正相關(guān)。而在采用同樣數(shù)量引物進(jìn)行比較研究時(shí),則可以更好地反映兩者的效果,如張敏等(2007)在鳶尾屬植物的研究中,均采用12個(gè)引物,RAPD和ISSR分別擴(kuò)增出225和196條帶,多態(tài)性條帶分別為215條和196條,多態(tài)性條帶百分率分別為95.56%和100.00%;種間總基因多樣度分別為0.3689和0.3575,相差值很小?；赗APD和ISSR標(biāo)記得到的鳶尾屬4個(gè)種類間的聚類結(jié)果一致,說明二者在種間關(guān)系的判定上是一致的。張敏等(2007,2008)在采用RAPD和ISSR法對(duì)比研究后,由于證明了RAPD的簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)勢(shì),而改為僅采用此方法來研究同樣的屬的其它種類的遺傳關(guān)系問題。本文作者是繼在國(guó)內(nèi)首次采用RAPD方法研究蘇鐵屬植物的遺傳關(guān)系后(黃玉源等,2009),在證明其適用于研究蘇鐵屬遺傳關(guān)系的基礎(chǔ)上,更廣泛和深入地探究21種蘇鐵屬植物的遺傳關(guān)系,將對(duì)于進(jìn)一步澄清蘇鐵屬植物的親緣關(guān)系及分類上的爭(zhēng)議問題提供重要依據(jù),同時(shí)也為蘇鐵屬植物資源的保護(hù)和利用等方面提供重要的理論參考。3.221.蘇鐵礦親屬分析3.2.1生物與生物的相似性關(guān)于蘇鐵屬的親緣演化問題,長(zhǎng)期以來一直存在爭(zhēng)議(Chen等,1999;黃玉源,2001;Hill,2003)。Chen等(1999)及王定躍(2000)認(rèn)為西林蘇鐵、多裂蘇鐵、尖尾蘇鐵、長(zhǎng)球果蘇鐵和隆林蘇鐵應(yīng)該歸并為叉孢蘇鐵,為一個(gè)種。Whitelock(2002)也把西林蘇鐵、多裂蘇鐵、長(zhǎng)球果蘇鐵歸入叉孢蘇鐵。黃玉源(2001)認(rèn)為雖然西林蘇鐵與叉孢蘇鐵有較多相似處,但可作近緣種處理,不能歸并。從圖2來看,所有供試種類中,多裂蘇鐵與叉孢蘇鐵最先聚在一起,它們的相似系數(shù)雖然較高,達(dá)0.7016,但是根據(jù)目前通行的是Lane&Wang(1993)提出的觀點(diǎn),只要生物與生物之間的遺傳相似系數(shù)在≤0.66,則為種之間的差異水平;0.67～0.90之間可視為亞種、變種及變型等各個(gè)分類等級(jí)的遺傳差異水平;≥0.91,可認(rèn)為是一個(gè)種、亞種、變種及變型各分類等級(jí)內(nèi)的不同個(gè)體。由于多裂蘇鐵與叉孢蘇鐵沒有達(dá)到相似系數(shù)≥0.91的水平,所以還不能歸為一個(gè)種類。本研究認(rèn)為:多裂蘇鐵應(yīng)作為叉孢蘇鐵的一個(gè)亞種對(duì)待,根據(jù)植物命名法則的優(yōu)先權(quán)原則,由于多裂蘇鐵后于叉孢蘇鐵發(fā)表,所以多裂蘇鐵應(yīng)為叉孢蘇鐵的一個(gè)亞種,叉孢蘇鐵為原亞種。雖然上述二者又與西林蘇鐵聚在一起,但是西林蘇鐵與叉孢蘇鐵的相似系數(shù)僅為0.6029,二者已經(jīng)相差很遠(yuǎn),明顯小于0.66的系數(shù)指標(biāo),本研究認(rèn)為,西林蘇鐵應(yīng)為一個(gè)獨(dú)立的種。西林蘇鐵與多裂蘇鐵的相似系數(shù)為0.6433,遠(yuǎn)小于0.91這個(gè)各種類之內(nèi)不同植株間相似系數(shù)水平,因此,研究結(jié)果同樣也不支持把西林蘇鐵和多裂蘇鐵歸入叉孢蘇鐵的觀點(diǎn)。尖尾蘇鐵與叉孢蘇鐵的相似系數(shù)為0.4892,長(zhǎng)球果蘇鐵與叉孢蘇鐵的相似系數(shù)為0.4897,尖尾蘇鐵與長(zhǎng)球果蘇鐵的相似系數(shù)為0.5467,表明三者之間的親緣關(guān)系都較遠(yuǎn)。此外,形態(tài)及解剖學(xué)研究表明(黃玉源,2001),尖尾蘇鐵和長(zhǎng)球果蘇鐵間有較大的差異;本研究結(jié)果也表明,將兩者與叉孢蘇鐵做歸并是很不合理的。隆林蘇鐵與叉孢蘇鐵的相似系數(shù)僅為0.3660,表明二者的親緣關(guān)系很遠(yuǎn),證明其相互間為獨(dú)立的種,研究結(jié)果完全不支持將前者歸入后者的觀點(diǎn)。3.2.2海南蘇鐵的形態(tài)王發(fā)祥等(1996)與黃玉源(2001)均認(rèn)為廣東蘇鐵與臺(tái)灣蘇鐵為同種異名,陳家瑞等(1999)則認(rèn)為海南蘇鐵與臺(tái)灣蘇鐵各自為獨(dú)立的種,它們的區(qū)別在于海南蘇鐵的大孢子葉側(cè)裂片數(shù)目比臺(tái)灣蘇鐵的少等。陳家瑞等(1999)把滇南蘇鐵、仙湖蘇鐵歸入臺(tái)灣蘇鐵,把臺(tái)灣蘇鐵叫做“廣東蘇鐵”;本研究作者在深圳仙湖植物園考察時(shí),發(fā)現(xiàn)有掛牌為廣東蘇鐵、拉丁名寫:Cycasguangdongensis的植株,進(jìn)而采集其材料,進(jìn)行此項(xiàng)比較研究。但在文獻(xiàn)上,關(guān)于其拉丁文的描述還未見,因此暫作為分類學(xué)上的裸名,用于分類上的探索性研究。正像Terrazas(1991)的研究那樣,采用不知名的蘇鐵材料時(shí),給予其Unknown或Cycassp.代號(hào),即可進(jìn)行探索研究,以便證明其分類地位,以便今后給予命名,這在植物學(xué)研究上為通行的做法。王發(fā)祥等(1996)在海南經(jīng)過廣泛調(diào)查后,發(fā)現(xiàn)蘇鐵屬植物的大孢子葉頂裂片形狀變異較大,臺(tái)灣蘇鐵與海南蘇鐵的模式類型為寬大的三角型,同時(shí)還存在從三角形到鉆形披針形的一系列過渡類型,側(cè)裂片的數(shù)目也有一定變化幅度,海南蘇鐵應(yīng)是臺(tái)灣蘇鐵的一個(gè)飾變類型,將海南蘇鐵歸并于臺(tái)灣蘇鐵。黃玉源(2001)認(rèn)為王發(fā)祥等在臺(tái)灣蘇鐵的形態(tài)描述上將海南蘇鐵的特征也一同描述在內(nèi),后者認(rèn)為臺(tái)灣蘇鐵有多個(gè)變異類型,那是因?yàn)樵诿枋雠_(tái)灣蘇鐵時(shí)把海南蘇鐵的大孢子葉的各形態(tài)均包含了進(jìn)去。黃玉源(2001)對(duì)這兩個(gè)種的解剖學(xué)研究結(jié)果表明,兩個(gè)種的顯微結(jié)構(gòu)差異很大,認(rèn)為海南蘇鐵與臺(tái)灣蘇鐵兩個(gè)均可各自成為獨(dú)立的種。本研究的RAPD分析結(jié)果表明,海南蘇鐵、臺(tái)灣蘇鐵與廣東蘇鐵在較小的相似系數(shù)水平0.56處聚在一起,廣東蘇鐵與海南蘇鐵的相似系數(shù)為0.5555,廣東蘇鐵與臺(tái)灣蘇鐵的相似系數(shù)為0.5581,海南蘇鐵與臺(tái)灣蘇鐵的相似系數(shù)為0.5597,三者的相似系數(shù)均達(dá)到種級(jí)分類水平,均距0.91的劃歸為同一個(gè)分類等級(jí)處理的水平相差很遠(yuǎn),說明海南蘇鐵、廣東蘇鐵與臺(tái)灣蘇鐵的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。三者都應(yīng)為各自獨(dú)立的種。3.2.3鐵和緬南蘇鐵的親緣關(guān)系陳家瑞等(1999)把仙湖蘇鐵、滇南蘇鐵歸入臺(tái)灣蘇鐵,而后(陳家瑞等,2003)又把仙湖蘇鐵稱作四川蘇鐵。而黃玉源(2001)經(jīng)過解剖學(xué)研究認(rèn)為,仙湖蘇鐵和滇南蘇鐵為各自獨(dú)立的種。本研究結(jié)果表明,仙湖蘇鐵與臺(tái)灣蘇鐵的相似系數(shù)僅為0.4121,遠(yuǎn)小于0.67的種級(jí)劃分界限,說明兩個(gè)種類的親緣關(guān)系相當(dāng)遠(yuǎn),為性狀差異很大的兩個(gè)不同的種。滇南蘇鐵與臺(tái)灣蘇鐵的相似系數(shù)僅為0.4395(雌)[0.4167(雄)],也小于種級(jí)劃分的界限,表明二者的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),因此不支持將仙湖蘇鐵和滇南蘇鐵歸入臺(tái)灣蘇鐵的觀點(diǎn)。仙湖蘇鐵和四川蘇鐵的相似系數(shù)僅為0.5036,表明二者的親緣關(guān)系也較遠(yuǎn),因此,支持三者為各自獨(dú)立的種的觀點(diǎn)。3.2.4叉葉蘇鐵和多羽叉葉蘇鐵的關(guān)聯(lián)陳家瑞等(1999)把多羽叉葉蘇鐵歸為叉葉蘇鐵,把長(zhǎng)柄叉葉蘇鐵歸并為多岐蘇鐵,而黃玉源(2001)則認(rèn)為三者應(yīng)各自成為獨(dú)立的種。本研究結(jié)果表明,長(zhǎng)柄叉葉蘇鐵和多羽叉葉蘇鐵雖然聚在一起,但是二者的相似系數(shù)僅為0.5714,小于0.67的的種級(jí)界限,說明二者的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),加之二者的外觀形態(tài)也存在較大的差異(黃玉源,2001),本研究結(jié)果表明,二者不應(yīng)歸并為同一個(gè)種。多羽叉葉蘇鐵與叉葉蘇鐵相似系數(shù)僅為0.4394,說明二者的親緣關(guān)系也比較遠(yuǎn),長(zhǎng)柄叉葉蘇鐵和叉葉蘇鐵的相似系數(shù)為0.4155,二者的親緣關(guān)系也比較遠(yuǎn)。因此,也不支持把多羽叉葉蘇鐵或長(zhǎng)柄叉葉蘇鐵歸為叉葉蘇鐵的觀點(diǎn)。研究結(jié)果支持長(zhǎng)柄叉葉蘇鐵、多羽叉葉蘇鐵和叉葉蘇鐵為三個(gè)各自獨(dú)立的種的觀點(diǎn)。3.2.5同種類型[0.6029雄陳家瑞等(1999)將元江蘇鐵和滇南蘇鐵歸并入寬葉蘇鐵,本研究結(jié)果表明,元江蘇鐵與滇南蘇鐵雖然聚在一起,但是二者的相似系數(shù)為0.6107(雌)[0.6094(雄)],已達(dá)種級(jí)分類水平,說明二者的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),加之二者的形態(tài)也有較大的差異(黃玉源,2001),因此,二者應(yīng)該為獨(dú)立的兩個(gè)自然種。Xiao等(2006)對(duì)寬葉蘇鐵、元江蘇鐵、十萬大山蘇鐵、潭清蘇鐵(C.tanqingii)和單羽蘇鐵(C.simplicipinna)5個(gè)種類的ISSR分子標(biāo)記的研究表明,元江蘇鐵不能與寬葉蘇鐵歸并,它們都是各自獨(dú)立的種,其結(jié)果與本研究的結(jié)果一致。3.2.6學(xué)者貿(mào)易等方面的混亂陳家瑞等(1999)把貴州蘇鐵歸為四川蘇鐵,而把歸并后的四川蘇鐵的中文名稱改為南盤江蘇鐵。我們認(rèn)為中文名也是不能隨意改動(dòng)的,也應(yīng)該具有法律效力,否則會(huì)在學(xué)術(shù)及貿(mào)易等方面造成混亂。王定躍(2000)、Whitelock(2002)和馬永等(2005)均把隆林蘇鐵歸入貴州蘇鐵,而王發(fā)祥等(1996)和黃玉源(2001)均認(rèn)為貴州蘇鐵和四川蘇鐵應(yīng)為兩個(gè)獨(dú)立的種。本研究聚類分析結(jié)果表明,隆林蘇鐵與貴州蘇鐵的相似系數(shù)僅為0.6071,已達(dá)種級(jí)分類水平,表明二者的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),不應(yīng)歸并為一個(gè)種。貴州蘇鐵和四川蘇鐵的相似系數(shù)為0.4183,遠(yuǎn)低于種級(jí)分類水平,表明二者的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),因此,支持三者各自為獨(dú)立的種的觀點(diǎn)。3.2.7元江蘇鐵、大山蘇鐵和寬葉蘇鐵的相似系數(shù)由表1陳家瑞等(1999)把元江蘇鐵與十萬大山蘇鐵歸入寬葉蘇鐵,而王發(fā)祥等(1996)和黃玉源(2001)等均認(rèn)為這三個(gè)種成立。本研究結(jié)果表明,元江蘇鐵與寬葉蘇鐵的相似系數(shù)為0.3484,十萬大山蘇鐵與寬葉蘇鐵的相似系數(shù)為0.3944,元江蘇鐵與十萬大山蘇鐵的相似系數(shù)為0.3697,三者的相似系數(shù)都十分的小,而且已遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于種級(jí)劃分的界限水平,表明三者的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。因此,不支持把元江蘇鐵與十萬大山蘇鐵歸入寬葉蘇鐵的觀點(diǎn)。這三個(gè)種是自然界獨(dú)立的物種。Pu等(1999)對(duì)寬葉蘇鐵、元江蘇鐵、十萬大山蘇鐵等的SSR分子遺傳標(biāo)記的研究也證明了這些種類相互間都是具有與其它種類明顯差異的獨(dú)立的物種,而且都達(dá)到種這個(gè)分類等級(jí)的水平。Xiao等(2006)的分子系統(tǒng)學(xué)研究結(jié)果也證明,十萬大山蘇鐵與寬葉蘇鐵的遺傳相似系數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于劃定為種的等級(jí)水平,認(rèn)為它們之間是相互獨(dú)立的很好的種,歸并是不正確的。這些研究結(jié)果與本研究的結(jié)果一致。3.2.8相似的種級(jí)劃分陳家瑞等(1999)把短葉蘇鐵歸入石山蘇鐵,本研究結(jié)果表明二者雖然聚在一起,但是它們的相似系數(shù)僅為0.4837,小于0.66的種級(jí)劃分的界限水平,說明二者的親緣關(guān)系是相當(dāng)遠(yuǎn)。加之二者外觀形態(tài)也有較大的差異,因此,這兩個(gè)種應(yīng)為各自獨(dú)立的種。3.2.9rapd和issr方法在群體分類及遺傳性狀上的相似系數(shù)和測(cè)序之前的ISSR與RAPD研究(馮麗春等,1997;劉萬勃等,2002;祁建民等,2003;肖炳光,2006;汪愛華等,2007;陳學(xué)軍等,2007;吳玉香等,2007)均表明,在同一個(gè)屬內(nèi)不同的種之間的遺傳相似性系數(shù)均在0.66以下,在亞種、變種等分類等級(jí)的不同個(gè)體的相似系數(shù)則在0.67～0.90之間,而在同一個(gè)種或變種等分類等級(jí)內(nèi)的不同個(gè)體之間如品種、品系的相似系數(shù)幾乎90%以上在接近或超過0.91以上的水平。這些充分證明了RAPD和ISSR兩種方法均可很好適用于種、亞種、變種和變型及各分類等級(jí)內(nèi)不同個(gè)體間的分類學(xué)及遺傳性狀差異的研究。RAPD分析結(jié)果表明,滇南蘇鐵雌雄類群的相似系數(shù)為0.9098,說明如果是一個(gè)種類的不同植株