第17章高效液相色譜法第17章高效液相色譜法1一、液相色譜概述二、HPLC儀器構(gòu)成三、液相色譜的固定相和流動相四、液相色譜法的分離類型及機理五、色譜分離方法的選擇主要內(nèi)容一、液相色譜概述主要內(nèi)容2一、概述一、概述3高效液相色譜（HPLC）是一種以液體為流動相的快速分離分析色譜技術(shù)。具有高壓、高速、高效、高靈敏度的特點，對于那些沸點高，熱穩(wěn)定性差，相對分子質(zhì)量大的有機化合物如烷烴、烯烴、芳烴、染料、蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等均可進(jìn)行分離分析。

1、高效液相色譜高效液相色譜（HPLC）是一種以液體為流1、高效液41）高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達(dá)10cm3·min-1.2）氣相色譜法分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機物總數(shù)的20％。對于占有機物總數(shù)近80％的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進(jìn)行分離和分析。高效液相色譜的優(yōu)點1）高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點在于高速、高效53）氣相色譜采用流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運載作用。而高效液相色譜法中流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭。因此，流動相對分離起很大作用，相當(dāng)于增加了一個控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。

4）氣相色譜一般都在較高溫度下進(jìn)行的，而高效液相色譜法則經(jīng)?？稍谑覝貤l件下工作。高效液相色譜的優(yōu)點3）氣相色譜采用流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產(chǎn)62、液相色譜儀器

（highperformanceliquidchromatograph）液相色譜儀（1）2、液相色譜儀器

（highperformanceli7液相色譜儀（2）液相色譜儀（2）8液相色譜儀（3）液相色譜儀（3）9液相色譜儀（4）LCQDecaXPMAX液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀液相色譜儀（4）LCQDecaXPMAX液相色譜質(zhì)譜聯(lián)10液相色譜儀（5）液相色譜儀（5）11二、HPLC儀器構(gòu)成1、流程二、HPLC儀器構(gòu)成1、流程122、

HPLC儀器組成：高壓輸液裝置→進(jìn)樣系統(tǒng)→分離系統(tǒng)→

檢測系統(tǒng)

2、HPLC儀器組成：13高壓輸液系統(tǒng)

(1)

貯液器

用來供給足夠數(shù)量的合乎要求的流動相以完成分析工作。材質(zhì)：玻璃、不銹鋼、氟塑料或特種塑料聚醚醚酮（PEEK）容積：0.5～2.0L放置位置：高于泵體，保持一定的輸液靜壓差注意：密封、過濾高壓輸液系統(tǒng)(1)貯液器14流動相過濾與脫氣裝置流動相過濾裝置分為在線過濾和真空過濾流動相脫氣裝置分為在線真空脫氣和超聲波脫氣流動相過濾與脫氣裝置15泵體材料耐腐蝕泵腔的體積要小，以便快速更換溶劑能在高壓下連續(xù)工作,耐壓40-50MPa.cm2壓力平穩(wěn)，無脈沖高壓輸液泵輸出流量穩(wěn)定，重復(fù)性高,輸出流量范圍寬(2)高壓輸液泵

泵體材料耐腐蝕泵腔的體積要小，以便快速更換溶劑能在高壓下連續(xù)16高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)17(3)梯度淋洗裝置

(內(nèi)梯度)(外梯度)梯度淋洗裝置(3)梯度淋洗裝置(內(nèi)梯度)(外梯度)梯度淋洗裝置18等度洗脫與梯度洗脫等度洗脫與梯度洗脫19梯度洗脫的特點

改善分離,加快分析速度；

改善峰形,減少拖尾;

可能引起基線漂移分配比變化范圍寬的復(fù)雜樣品應(yīng)采取梯度洗脫方式分離梯度洗脫的特點改善分離,加快分析速度；分配比變化范圍寬的201)對樣品有一定的溶解度，以防在柱頭產(chǎn)生沉淀。2)適用于所選擇的檢測器。3)化學(xué)惰性好，以免破壞固定相。4)低粘度，增加樣品的擴散系數(shù)，提高柱效。5)純度高。溶劑不純會增加檢測器噪聲，產(chǎn)生偽峰。流動相溶劑選擇的一般要求1)對樣品有一定的溶解度，以防在柱頭產(chǎn)生沉淀。流動相溶劑選21(2)

進(jìn)樣系統(tǒng)

進(jìn)樣針

六通閥(2)進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣針六通閥22

準(zhǔn)備狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài)

六通閥進(jìn)樣裝置準(zhǔn)備狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài)六通閥進(jìn)23

六通閥進(jìn)樣裝置的使用及保養(yǎng)1、進(jìn)樣樣品要求無微粒和能阻死針頭及進(jìn)樣閥的物質(zhì)，樣品溶液均要用0．45微米的濾膜過濾。2、進(jìn)樣時，針頭外側(cè)緊貼進(jìn)樣器密封管內(nèi)側(cè)，以免漏液和引入空氣；另外，也防止了針頭刺壞密封組件及定子。3、進(jìn)樣時，要求完全置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，以此提高精密度及重現(xiàn)性。4、進(jìn)樣時，手柄處于Load和Inject之間時，應(yīng)盡快轉(zhuǎn)閥，不能停留在中途。5、每次結(jié)束后應(yīng)反復(fù)沖洗進(jìn)樣器再用無纖維紙擦凈注射器針頭的外側(cè)。六通閥進(jìn)樣裝置的使用及保養(yǎng)1、進(jìn)樣樣品要求無微粒和能阻死24(3)分離系統(tǒng)

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。色譜柱(3)分離系統(tǒng)柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1251．使用預(yù)柱保護(hù)分析柱(硅膠在極性流動相/離子性流動相中有一定的溶解度)。2．大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2－7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍。3．避免流動相組成及極性的劇烈變化。4．流動相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理。5．如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相，應(yīng)在實驗完畢柱子沖洗干凈，并保存大乙腈中。6．壓力升高是需要更換預(yù)柱的信號。色譜柱的使用和維護(hù)1．使用預(yù)柱保護(hù)分析柱(硅膠在極性流動相/離子性流動相中有色26(4)液相色譜檢測器a.紫外檢測器b.光電二極管陣列檢測器c.示差折光檢測器d.

熒光檢測器e.電導(dǎo)檢測器f.質(zhì)譜檢測器(4)液相色譜檢測器a.紫外檢測器27a.紫外檢測器

應(yīng)用最廣，對大部分有機化合物有響應(yīng)。特點：

靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm×10mm，容積8μL）；對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。a.紫外檢測器28b.光電二極管陣列檢測器

紫外檢測器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。b.光電二極管陣列檢測器紫外檢測器的重要進(jìn)展；29儀器分析----第17章-高效液相色譜法課件30兩種檢測器的色譜圖(a)：可變波長紫外檢測器；(b)：二極管陣列檢測器兩種檢測器的色譜圖31紫外普通檢測器和光電二極管陣列檢測器的比較普通檢測器光電二極管陣列檢測器紫外普通檢測器和光電二極管陣列檢測器的比較普通檢測器光電二極32紫外檢測器靈敏度高，精密度及線性范圍較好，可用于梯度洗脫。流動相選擇有限制。一些常用溶劑的紫外截止波長溶劑CS2氯仿四氫呋喃苯乙腈甲醇水紫外截止波長/nm380245212210190205187紫外檢測器靈敏度高，精密度及線性范圍較好，可用于梯度洗脫。33c.示差折光檢測器

除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器；可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種。c.示差折光檢測器

除紫外檢測器之外應(yīng)用最34示差折光檢測器示差折光檢測器35d.熒光檢測器

熒光檢測器是高壓液相色譜儀常用的一種檢測器。用紫外線照射色譜餾分，當(dāng)試樣組分具有熒光性能時，即可檢出。其特點是選擇性高，只對熒光物質(zhì)有響應(yīng)；靈敏度也高，最低檢出限可達(dá)10-12g/ml，適合于多環(huán)芳烴及各種熒光物質(zhì)的痕量分析。也可用于檢測不發(fā)熒光但經(jīng)化學(xué)反應(yīng)后可發(fā)熒光的物質(zhì)。如在酚類分析中，多數(shù)酚類不發(fā)熒光，為此先經(jīng)處理使其變?yōu)闊晒馕镔|(zhì)，而后進(jìn)行分析。d.熒光檢測器

熒光檢測器是高壓液相色譜儀361、固定相

高效液相色譜固定相根據(jù)其承受壓力來分，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體：二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.0×108～1.0×109Pa的高壓，如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團(tuán)，就是鍵合固定相它是目前最廣泛使用的一種固定相。硬膠：主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5×108Pa。三、高效液相色譜的固定相和流動相

1、固定相三、高效液相色譜的固定相和流動相37

固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。

表面多孔型：基體是實心玻璃珠，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酸胺等。這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達(dá)平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固38

全多孔型固定相：它由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。也可由氧化鋁微粒凝聚成全多孔型固定相，這類固定相由于顆粒很細(xì)（5～10μm），孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析。全多孔型固定相：它由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成39

40按流動相組成分：單組分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。

采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時間。2、液相色譜的流動相液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；按流動相組成分：單組分和多組分；2、液相色譜的流動相液相色譜41流動相選擇

在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。

常用溶劑的極性順序：

水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)流動相選擇在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要42選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題（1）盡量使用高純度試劑作流動相43四、液相色譜分離類型與原理1、液-固吸附色譜

固定相：固體吸附劑為硅膠、氧化鋁、活性炭等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑?；驹恚航M分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；

適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性。缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾。四、液相色譜分離類型與原理1、液-固吸附色譜

44固定相與流動相均為液體（互不相溶）；基本原理：組分在固定相和流動相上的分配；流動相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性（正相），反之，流動相的極性大于固定液的極性（反相）。固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；（薄殼型微珠擔(dān)體）30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底；化學(xué)鍵合固定相：（將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反柱）。2、液-液分配色譜固定相與流動相均為液體（互不相溶）；2、液-液分配色譜45分離原理K不僅與固定相的種類有關(guān)，也與流動相的種類有關(guān)分離原理K不僅與固定相的種類有關(guān)，也與流動相的種類有關(guān)46固定相極性>流動相極性正相分配色譜組分極性越大，保留時間越長反相分配色譜組分極性越小，保留時間越長流動相極性>固定相極性固定相極性>流動相極性正相分配色譜組分極性越大，保留時間越長47儀器分析----第17章-高效液相色譜法課件483、化學(xué)鍵合相色譜采用化學(xué)鍵合相的液相色譜固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失。由于可將各種極性的官能團(tuán)鍵合到載體表面，因此它適用于種類繁多樣品的分離。特點3、化學(xué)鍵合相色譜采用化學(xué)鍵合相的液相色譜固定相非常穩(wěn)定，在491.鍵合固定相制備ODS(C18)鍵合相硅膠十八烷基氯硅烷非極性硅烷化反應(yīng)使用pH范圍：2-81.鍵合固定相制備ODS(C18)鍵合相硅膠十八烷基氯硅烷50鍵合固定相類型疏水基團(tuán)烷烴（C8和C18）、苯基等極性基團(tuán)丙氨基氰乙基醚和醇等離子交換基團(tuán)胺基、季銨鹽磺酸、羧酸鍵合固定相類型疏水基團(tuán)極性基團(tuán)離子交換基團(tuán)512.鍵合相色譜法分類

反相鍵合相色譜:常用固定相：C18分離對象非極性中等極性化合物常用流動相甲醇-水乙睛-水反相鍵合相色譜疏溶劑分離機制固定相極性<流動相極性2.鍵合相色譜法分類反相鍵合相色譜:常用固定相：C18分52

正相鍵合相色譜

固定相極性>流動相極性

離子性鍵合相色譜將各種離子交換基團(tuán)化學(xué)鍵合到硅膠基質(zhì)表面上，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相。其分離原理與離子交換色譜類同。

正相鍵合相色譜離子性鍵合相色譜53例：甲苯和苯酚的分離。流動相：甲醇-水出峰順序：苯酚，甲苯出峰順序：甲苯，苯酚十八烷基鍵合相二醇基鍵合相例：甲苯和苯酚的分離。流動相：甲醇-水出峰順序：苯酚，甲苯出54保留時間：<例：以O(shè)DS鍵合色譜柱、甲醇-水為流動相分離以下兩種苯甲酸，試判斷出峰次序。沒食子酸3,4-二羥基苯甲酸固定相:非極性;流動相:極性組分極性:3,4-二羥基苯甲酸<沒食子酸保留時間：<例：以O(shè)DS鍵合色譜柱、甲醇-水為流動相分離以下55

56此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用無機離子混合物的分離，亦可用于有機物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。4、離子交換色譜此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定57離子交換原理

離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子。當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換。離子交換原理58陽離子交換樹脂陽離子交換陰離子交換其交換反應(yīng)通式如下：陽離子交換樹脂陽離子交換陰離子交換其交換反應(yīng)通式如下：59

達(dá)平衡時，以濃度表示的平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)的選擇系數(shù)）：

式中[A]r，[B]r分別代表樹脂相中洗脫劑離子（A）和試樣離子（B）的濃度，[A]、[B]則代表它們在溶液中的濃度。離子交換反應(yīng)的選擇性系數(shù)見從表示試樣離子B對于A型樹脂親和力的大?。篕B/A越大，說明B離子交換能力越大，越易保留而難于洗脫。一般說來，B離子電荷越大，水合離子半徑越小，KB/A值就越大。一般形式：R一A＋B＝R－B＋A

達(dá)平衡時，以濃度表示的平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)的選擇系數(shù)）60

對于典型的磺酸型陽離子交換樹脂，一價離子的KB/A值按以下順序：

Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+二價離子的順序為：

Ba2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞Cu2+，Zn2+＞Mg2+對于季銨型強堿陰離子交換樹指，各陰離子的選擇性順序為：

ClO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-＞HCO3-＞H2P04-＞IO3-＞CH3COO－＞F－對于典型的磺酸型陽離子交換樹脂，一價離子的KB/A值按以61

固定相

作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽離子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有強弱之分。固定相62流動相

離子交換色譜法所用流動相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強度）的緩沖溶液。通過改變流動相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競爭吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。對于陰離子交換樹脂來說，各種陰離子的滯留次序為：

檸檬酸離子＞SO42－＞C2O42-＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN-＞Cl-＞HCOO-＞CH3C00-＞OH-＞F-所以用檸檬酸離子洗脫要比用氟離子快。流動相離子交換色譜法所用流動相大都是一定pH和鹽63陽離子的滯留次序大為：

Ba2+＞Pb2+＞Ca2+＞Ni2+＞Cd2+＞Cu2+＞Co2+＞Zn2+＞Mg＞Ag+＞Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li十但差別不如陰離子明顯。關(guān)于pH值的影響，要視不同情況而定。例如，分離有機酸和有機堿時，這些酸堿的離解程度可通過改變流動相的pH值來控制。增大pH值會使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低PH值，其結(jié)果相反。但無論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會使樣品的保留增大。

儀器分析----第17章-高效液相色譜法課件64

5、尺寸排阻色譜

尺寸排阻色譜法又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離的。

5、尺寸排阻色譜尺寸排阻色譜法又稱凝膠色譜法，主要用于65

分離原理

尺寸排阻色譜是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法。其固定相為化學(xué)情性多孔物質(zhì)——凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其滲透過程模型見下圖。分離原理66排阻色譜分離示意圖相對分子質(zhì)量差別大于10％的化合物才可以分離排阻色譜分離示意圖相對分子質(zhì)量差別67固定相排阻色譜固定相種類很多，一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。所謂凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。（1）軟性凝膠如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。

固定相68

（2）半剛性凝膠如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機溶劑作流動相。用于高效液相色譜時，流速不宜大。（3）剛性凝膠如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑，又可用有機溶劑作流動相，可在較高壓強和較高流速下操作。一般控制壓強小于7MPa，流速＜1cm