第二十二章局部用藥的毒性研究第二十二章局部用藥的毒性研究1案例

★痤瘡是一種毛囊皮脂炎癥，多發(fā)于青年男女面部、胸部等皮脂分泌旺盛的區(qū)域，持續(xù)時間長，且易反復發(fā)作。

◆克林霉素-過氧苯甲酰凝膠是由克林霉素磷酸脂與過氧苯甲酰制成的復方制劑，臨床用于痤瘡治療。要求觀察其對皮膚的刺激性與過敏反應。案例★痤瘡2

局部用藥的毒性試驗是根據(jù)局部用藥部位的解剖和生理特點設計的。

涂劑、擦劑皮膚用藥膏劑、凝膠劑其他透皮吸收制劑常用局部用藥制劑滴眼劑、滴鼻劑噴霧劑直腸和陰道制劑肌內注射

局部用藥的毒性試驗是根據(jù)局部用藥部3第一節(jié)皮膚用藥的毒性研究皮膚組織結構

表皮真皮皮下組織第一節(jié)皮膚用藥的毒性研究皮膚組織結構4

皮膚覆蓋全身。表皮較薄，厚為0.1-0.2mm。角質層

表皮顆粒層生發(fā)層真皮依附于皮下組織，厚約2mm。膠原

真皮彈性硬蛋白纖維母細胞皮膚覆蓋全身。5一、化學物質對皮膚毒性作用的類型根據(jù)性質不同，由藥物引起的皮膚損害包括原發(fā)性刺激炎癥反應和致敏反應，偶然也可引起皮膚癌。一、化學物質對皮膚毒性作用的類型根據(jù)性質不同，6（一）皮膚原發(fā)性刺激

原發(fā)性刺激—藥物直接作用于皮膚引起的病理性反應。紅斑、水腫原發(fā)性刺激的表現(xiàn)水皰瘡潰瘍（一）皮膚原發(fā)性刺激7

強堿脂溶性溶劑原發(fā)性刺激機理鎘酸鹽銀、汞、砷等金屬鹽

特征：

有明確的毒理學量-效關系。首次接觸即可產生某種特征。局部用藥的毒性研究課件8（二）皮膚致敏

皮膚致敏為變態(tài)反應，包括：藥物致敏和光敏反應。

作用機制

藥物與蛋白以共價鍵結合，具用免疫原性。藥物在光的作用下，形成半抗原性物質。

特征

沒有明確的毒理學量-效關系。再次接觸該藥物才能激發(fā)特定癥狀。（二）皮膚致敏9（三）皮膚致癌

有機大分子化合物----多環(huán)芳烴類金屬鹽----無機砷鹽（三）皮膚致癌10（一）皮膚用藥急性毒性實驗

1.定義：

指動物完整或破損皮膚一次性接觸受試物后在短期內出現(xiàn)的毒性反應實驗。2.受試物：

使用臨床制劑，如臨床制劑濃度無法滿足劑量要求，受試物為粉末狀的用適宜基質（如凡士林、羊毛脂等）溶解混勻。

（一）皮膚用藥急性毒性實驗1.定義：113.實驗動物及實驗條件每組動物數(shù)：

一般選白色家兔、小型豬4-6只，大鼠或豚鼠10只，雌雄各半；動物體重：

家兔2-3kg，豚鼠200-300g，大鼠200-250g，小型豬30-40kg。

飲食、攝水：

自由飲食、攝水。

動物房溫濕度：家兔、豚鼠及小型豬控制在18-26℃；大鼠控制在20-25℃，相對濕度均為40%-70%；換氣次數(shù)為10-20次/min；12h明暗交替光照。3.實驗動物及實驗條件124.劑量設計

至少應設三個劑量組，另設賦形劑對照組，必要時設空白對照組。如受試物在擬用臨床給藥時有可能與破損皮膚接觸，則應另設破損皮膚組。

4.劑量設計135.實驗操作

給藥前24h對給藥區(qū)（通常在背部）進行脫毛處理，給藥時將受試物均勻涂于動物脫毛區(qū)，液體制劑，應將受試物涂于敷料上，再貼于脫毛或破損皮膚區(qū)，用半封閉的外罩固定敷料。涂敷24h后，除去敷料，用溫水或適宜的溶劑除去殘留的受試物和賦形劑。

5.實驗操作14觀察期：

連續(xù)觀察14d，觀察1-2次/天。也可根據(jù)出現(xiàn)毒性反應的情況適當延長。

觀察指標：

給藥前后7d、14d稱體重，觀察給藥后動物的全身反應：皮毛、眼睛、黏膜、呼吸、行為、自主活動、肌張力等，有無顫抖、震顫、抽搐、流涎、腹瀉、少動、精神萎靡不振、

昏迷等毒性反應癥狀。若有動物死亡應立即進行尸檢，

有明顯異常時，應進一步進行病理組織學檢查。6.觀察指標觀察期：

連續(xù)觀察14d，觀察1-2次/天。157.結果評價對觀察到的陽性癥狀結合大體解剖或病理組織學結果進行綜合分析，與對照組比較，對動物的毒性反應及死亡原因作出明確判斷。病理組對照組7.結果評價病理組對照組16（二）皮膚給藥長期毒性實驗1.定義指動物完整或破損皮膚長期反復接觸受試物后出現(xiàn)的毒性反應及其可逆程度實驗。2.受試物與“皮膚給藥急性毒性試驗”基本相同。3.實驗動物及條件與“皮膚給藥急性毒性試驗”一致。

（二）皮膚給藥長期毒性實驗1.定義174.劑量設計至少應設三個劑量組.

(可設賦形劑對照組，必要時設空白對照組。)高劑量：原則上應使動物產生明顯的毒性反應，甚至出現(xiàn)個別動物死亡；低劑量：原則上應高于動物藥效學實驗的等效劑量，并不使動物出現(xiàn)毒性反應；中劑量：動物可出現(xiàn)輕度毒性反應。4.劑量設計185.給藥期限藥物臨床療程皮膚給藥長期毒性實驗給藥期限可以支持的臨床研究階段單次給藥2周Ⅱ期，Ⅲ期（及生產）≤2周1個月Ⅱ期，Ⅲ期（及生產）2周~1個月1個月Ⅱ期3個月Ⅲ期（及生產）≤3個月3個月Ⅱ期6個月Ⅲ期（及生產）≤6個月6個月Ⅱ期，Ⅲ期（及生產）>6個月6個月Ⅱ期，Ⅲ期（及生產）5.給藥期限藥物臨床療程皮膚給藥長期毒性實驗給藥期限可以支持196.給藥頻率★給藥期限<3個月，原則上應每天給藥；★給藥期限≥3個月，每周至少應給藥6d；

★也可根據(jù)臨床給藥頻率給藥。6.給藥頻率207.恢復期限

給藥結束后保留部分動物，繼續(xù)觀察其可能出現(xiàn)的延遲性毒性反應，并了解毒性反應的可逆程度。根據(jù)受試物的藥代動力學特點、靶器官或靶組織的毒性反應和實際恢復情況確定恢復期的長短。

7.恢復期限218.實驗操作

首次給藥前24h對給藥區(qū)在背部進行脫毛處理。每天給藥1次，每次至少接觸6h。保證受試物與給藥部位具有良好接觸并避免動物食入藥物。可用紗布等無刺激性輔料包裹或給動物穿上特制的通透性好的外套。8.實驗操作229.觀察指標

除增加給藥部位皮膚及其周圍組織乃至全身皮膚變化和皮膚病理學檢查外，其余指標與長期毒性實驗要求一樣。9.觀察指標除增加給藥部位皮膚及其周圍組織23

10.結果評價局部毒性反應的結果評價與長毒實驗要求一樣，應根據(jù)各檢測指標及病理組織學檢查結果綜合分析。除此以外還應注意評價給藥局部及其周圍組織的毒性反應。10.結果評價24（三）皮膚刺激性實驗1.定義：皮膚刺激性：指經皮膚給藥后，在皮膚上產生的可逆性炎性病變。

（若給藥部位產生了不可逆性的組織損傷則稱為腐蝕性。）皮膚刺激性實驗：是觀察動物的皮膚接觸受試物后是否引起紅腫、充血、滲出等局部反應。（三）皮膚刺激性實驗1.定義：252.受試物

應采用與臨床應用制劑一致，符合臨床用質量標準規(guī)定的受試物進行實驗，同時注明其名稱、來源、批號、含量（或規(guī)格）、賦形劑、保存條件及配制方法等，其中賦形劑和雜質等的名稱和量應盡可能明確，并附有研制單位的自檢報告。所用賦形劑應該標明批號、規(guī)格和生產廠家，并符合實驗要求。2.受試物263.實驗動物多種哺乳動物可以選擇，一般首選白色家兔，每組動物數(shù)4～8只，雌、雄各半。也可以選用其他種屬的動物(如小型豬等),選擇家兔和小型豬以外的動物應闡明合理性。3.實驗動物274.實驗操作

設賦形劑對照，采用同體左右側自身對比法。試驗前24h對給藥區(qū)進行脫毛處理。去毛范圍各3cm×3cm。(給藥前應檢查去毛皮膚是否因去毛而受損傷，有損傷的皮膚不宜進行實驗。)進行破損皮膚的刺激性研究時，在用藥部位用砂紙磨或劃“井”字并以滲血為度。

4.實驗操作284.實驗操作受試物藥量一般是固體或半固體0.5g，液體0.5ml，直接涂布于一側已去毛的皮膚上，然后用兩層紗布(2.5cm×2.5cm)和一層玻璃紙或類似物覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定；另一側涂布賦形劑做對照。貼敷時間至少4h。貼敷結束后，除去受試物并用溫水或無刺激性溶劑清潔給藥部位。注：多次給藥皮膚刺激性實驗應連續(xù)在同一部位給藥，每次給藥時間相同，貼敷期限一般不超過4周。4.實驗操作29刺激反應分值刺激反應分值紅斑無紅斑0輕度紅斑（勉強可見）1中度紅斑（明顯可見）2重度紅斑3紫紅色紅斑到輕度焦痂形成4水腫無水腫0輕度水腫（勉強可見）1中度水腫（明顯隆起）2重度水腫（皮膚隆起1mm，輪廓清楚）3嚴重水腫（皮膚隆起1mm以上并有擴大）4總分值85.觀察指標在自然光線或全光譜燈光下觀察皮膚反應。按表給出的評分標準對皮膚紅斑和水腫進行評分。刺激反應306.結果評價單次給藥實驗：計算每一觀察時間點各組受試物及賦形劑皮膚反應積分的平均分值，按表進行刺激強度評價。

多次給藥實驗：首先計算每一觀察時間點各組積分均值，然后計算觀察期限內每天每只動物積分均值，按表進行刺激強度評價。分值評價分值評價0~0.49無刺激性0.5~2.99輕度刺激性3.0~5.99中度刺激性6.0~8.0強刺激性6.結果評價分值31（四）皮膚吸收試驗（1）整體皮膚吸收試驗

化合物經皮滲透的量同皮膚微灌流量直接相關，通過測量與皮膚灌流量相關的電壓，測算出化學經皮吸收速率。

1）LDV法

用643.8nm氦-氖激光，照射血管中流動中的紅細胞，測量用藥前后變化，測定出皮膚吸收速度。（四）皮膚吸收試驗（1）整體皮膚吸收試驗32PPG法

LED射出的800-940nm紅外線照射，收集反射光轉變成電壓波譜，通過電壓波譜變化，計算皮膚吸收量的大小。PPG法33（2）離體皮膚吸收試驗靜態(tài)滲透裝置上室防藥劑，下室接受液，下室中間方皮膚并密封，藥劑放于皮膚之上，每隔一定時間后，測定接受液，計算皮膚滲透率。流動滲透裝置上述方法的改進，接受液為血漿或白蛋白，以5ml/小時的速度灌流，測定不同時間灌流液的藥量。以次測定皮膚的透過率。（2）離體皮膚吸收試驗34（五）皮膚過敏試驗目的通過動物皮膚重復接觸受試物，觀察機體免疫系統(tǒng)反映在皮膚上的表現(xiàn)。方法實驗材料1）動物-豚鼠2）受試藥物-膏劑、液體不稀釋直接涂敷3）陽性致敏物：2,4-二硝基氯代苯1%-致敏濃度0.1%-激發(fā)濃度（五）皮膚過敏試驗目的35試驗方法

1）試驗分組隨機分成三組：給藥組、賦形劑組、陽性對照組2）致敏接觸0.1-0.2ml(g)涂于脫毛區(qū)，接觸6小時，第7天和14天亦同樣方法重復。3）激發(fā)接觸末次給藥后第14天，激發(fā)給藥，6、24、48和72小時觀察皮膚過敏情況。試驗方法36結果判斷與評價皮膚過敏反應評分標準刺激反應程度分值刺激反應程度分值紅斑形成水腫形成無紅斑0無水腫0輕度紅斑1輕度水腫1中度紅斑2中度水腫2重度紅斑3重度水腫3水腫性紅斑4最高總分值7結果判斷與評價37致敏率分類過敏反應強度致敏率%弱致敏性0-10輕度致敏性10-30中度致敏性30-60高度致敏性60-80極度致敏性80-100紅斑形成總分+水腫形成總分反應平均值=合計動物總數(shù)致敏率分類38（六）皮膚光敏試驗目的觀察受試物接觸皮膚后遇光照否有光敏反應試驗方法1）光敏反應試驗評價標準2）光毒性試驗評價標準（六）皮膚光敏試驗目的39第二節(jié)眼睛用藥刺激性試驗眼睛的結構第二節(jié)眼睛用藥刺激性試驗眼睛的結構40

角膜結膜炎炎癥角膜表面水腫上皮脫落刺激作用結膜充血、水腫灼痛、流淚、畏光

慢性結膜炎、瞼腺炎、分泌物增多局部用藥的毒性研究課件41

試驗目的

角膜渾濁刺激性試驗

試驗方法

虹膜

結果與評價

結膜水腫分泌物

42目的觀察動物眼睛接觸受試物所產生的刺激反應方法家兔，原液（原膏）加入眼睛腫0.1ml(0.1g)，閉合5-10分鐘。6、24、48和72小時至7天眼刺激情況。結果與評價目的43眼刺激反應評分眼刺激反應分值角膜渾濁0-4虹膜0-2結膜0-3水腫0-4分泌物0-3總分16眼刺激反應評分44眼刺激性評價標準刺激程度積分無刺激性0-3輕度刺激性4-8中度刺激性9-12重度刺激性13-16眼刺激性評價標準刺激程度45第三節(jié)肌內注射用藥局部刺激性試驗目的肌內注射后藥物對肌肉的刺激性反應情況。方法家兔6只，一側骨四頭肌注射供試物，另一側注射生理鹽水1-2ml作為對照，48小時處死動物，取骨四頭肌縱向剖開，肉眼觀察，觀察注射部位刺激情況，必要時作組織病理學檢查。第三節(jié)肌內注射用藥局部刺激性試驗目的46家兔股四頭肌肌肉組織家兔股四頭肌肌肉組織47結果與評價肌內注射刺激反應評分標準反應級數(shù)刺激反應0給藥部位無明顯反應1給藥部位輕度充血，直徑0.5cm以下2給藥部位中度充血，直徑1.0cm以下3給藥部位中度充血，紅腫，肌肉有變性4出現(xiàn)肌肉褐色變性，壞死0.5cm以下5肌肉嚴重變性，出現(xiàn)大片壞死超過2認為不符合規(guī)定，不可進行肌內注射結果與評價48第四節(jié)靜脈給藥局部刺激性試驗

見第二十章：全身用藥毒性試驗中-血管刺激性試驗第四節(jié)靜脈給藥局部刺激性試驗見第二十章：全身用藥毒性49第五節(jié)滴鼻劑和吸入劑的毒性試驗一、滴鼻劑和吸入劑急性毒性試驗目的觀察受試物一次滴入或吸入后對動物產生的毒性反應或死亡情況。方法3個劑量組，組距0.65-0.85,滴入或吸入；4小時后即可以及7-14天觀察動物。結果評價第五節(jié)滴鼻劑和吸入劑的毒性試驗一、滴鼻劑和吸入劑急性毒性試50二、滴鼻劑和吸入劑刺激性試驗目的觀察受試物一次滴入或吸入后對動物產生的刺激反應。方法將受試物滴入或噴霧于動物，24小時后處死動物，觀察有無充血、紅腫等。結果評價二、滴鼻劑和吸入劑刺激性試驗51第六節(jié)應用于直腸、陰道制劑的毒性試驗一、直腸、陰道用藥急性毒性試驗目的受試物對動物直腸或陰道產生的毒性反應或死亡情況。方法栓劑、膏劑或液體等，將受試物輕置入直腸或陰道內。至少接觸4小時，觀察即可以及7-14天的情況。結果評價第六節(jié)應用于直腸、陰道制劑的毒性試驗一、直腸、陰道用藥急性52二、直腸、陰道用藥長期毒性試驗目的方法結果評價二、直腸、陰道用藥長期毒性試驗53三、直腸、陰道用藥刺激性試驗目的方法結果評價四、有關問題

1、給藥量與給藥濃度2、給藥途徑3、多次給藥問題4、對照組的建立三、直腸、陰道用藥刺激性試驗541.實驗動物的選擇依據(jù)擬采用的實驗模型和觀察指標選擇實驗動物，一般每個實驗選擇一種動物進行評價。2.給藥的頻率與期限給藥的頻率與期限應依據(jù)擬定臨床應用的情況來決定。重復給藥的制劑，一般每天給藥一次，給藥期限最長不超過4周。單次給藥的制劑可用單次給藥的方法進行實驗。3.可逆性觀察為明確毒性反應的性質，建議進行停藥后恢復期的觀察。局部毒性反應的可逆性評價應包括局部及相關部位的反應。小結：注意問題1.實驗動物的選擇小結：注意問題554.受試物受試物應與臨床應用制劑一致。5.對照組以溶媒和是（或）賦形劑作陰性對照，必要時用已上市制劑作對照。6.劑量劑量設計主要應該考慮受試物濃度和總劑量。一般采用與