微囊藻細(xì)菌的分離及其對水華藻類的控制

滇池是中國西南部的一個大型平湖。在過去的10年里，池塘里藍(lán)藻水的發(fā)病率和數(shù)量顯著增加。其中微囊藻(Microcystisspp.)水華是危害最嚴(yán)重的一類,由于這類水華發(fā)生普遍,持續(xù)時間長,而且多數(shù)產(chǎn)毒,危害性很大,因而倍受人們的關(guān)注。人們不斷致力于微囊藻水華的消除、其毒素的降解、危害防治等方面的研究,期望減少以至消除微囊藻對生態(tài)系統(tǒng)和人類健康的影響。對于控制水體中有毒藻類及其負(fù)面影響乃至最終消除,人們采取了多種措施,總的說來為兩種基本途徑:一是控制它們在水體中的生長繁殖而保持其較低的生物量,二是采用各種辦法來殺死它們。通過微生物的方法來控制有害藻類是人們探索的途徑之一。其中溶藻細(xì)菌對水華的控制、維持藻的生物量平衡有非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)主要從細(xì)菌與水華藻類的關(guān)系角度來展開研究,首先從滇池中分離出80多個菌株,分析其各自與微囊藻種群增長之間促、控、抑或共存的關(guān)系;然后選擇對微囊藻有較大影響的細(xì)菌,進(jìn)行抑藻、溶藻或裂藻的試驗(yàn)觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,滇池中存在著一些對微囊藻生長有顯著影響的細(xì)菌,其中細(xì)菌DC23的溶藻能力十分強(qiáng),接入3d內(nèi)能夠?qū)饩G的培養(yǎng)液變成乳白色;經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng),在10L水平的試驗(yàn)具有同樣效果。該菌株的分離發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步從細(xì)胞分子水平上探究藻-菌關(guān)系,探索溶藻細(xì)菌可能的控藻技術(shù)提供了前提條件。1材料和方法1.1保藏中心和培養(yǎng)模式選用的M.aeruginosa.,M.wessenbergii,M.viridis取自本所藻種保藏中心(FACHB)。Scenedesmus和Aphanizomenon自云南滇池分離。在23—25℃,光照強(qiáng)度為2000lx,及光暗周期16h:8h的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)基為BG11。1.2溶藻細(xì)菌的分離純化2002年10月—12月以及2003年8月—9月,從云南滇池中采水樣進(jìn)行溶藻細(xì)菌的分離,純化并編號,然后將分離的菌株接入藻液中,設(shè)有空白對照。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌DC23對藻的生長有明顯抑制作用。1.3菌接種量、培養(yǎng)時間與od值在TSB培養(yǎng)基(胰酶大豆肉湯)中接入細(xì)菌,接種量為10%(108個/mL),30℃振蕩培養(yǎng)(100r/min),定時取樣,并測其在420nm下的OD值。1.4細(xì)胞形態(tài)特征檢測(a)液體溶藻按照每30mL藻液加3mL菌液的方式進(jìn)行,設(shè)空白對照。定時在顯微鏡下觀察,并隔天測量其葉綠素含量。菌液選擇不同的濃度梯度(103—1010個/mL)進(jìn)行試驗(yàn)。(b)固體溶藻取濃縮過的藻液2mL用固體培養(yǎng)基(BG11+1%瓊脂)培養(yǎng),置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4d,再按不同濃度接入細(xì)菌DC23,觀察其溶藻現(xiàn)象。(c)水槽溶藻取一組6個相同規(guī)格(30×30×70cm3)的玻璃水槽,置于室外。從滇池基地集藻區(qū)取水樣加入玻璃水槽中(每格水槽的水樣均為36L),按不同濃度接入細(xì)菌DC23,并定時攪動水樣。試驗(yàn)過程中不定期地觀察、拍攝試驗(yàn)現(xiàn)象,顯微鏡下觀察藻細(xì)胞的形態(tài)特征變化;定期測定水體的葉綠素含量。1.5葉綠素?zé)晒鉁y定用便攜式植物效率分析儀(PEA,HansatechR,U.K.)測定葉綠素?zé)晒?。激發(fā)光強(qiáng)為最大光強(qiáng)的50%(1500μE-2·S-1),暗適應(yīng)時間不少于15min,記錄時間5s,測定均在室溫下進(jìn)行。用可變熒光(Fv)與最大熒光(Fm)的比值Fv/Fm表示光合效能活性的大小。1.6制備適應(yīng)證取0.5g鮮藻樣品,加5%TCA(三氯乙酸)5mL,研磨后所得勻漿在3000r/min下離心10min;取上清液2mL,加0.67%TBA(硫代巴比妥酸)2mL,混合后在100℃水浴上煮沸30min,冷卻后再離心一次;分別測定上清液在450nm、532nm、600nm處的吸光度值,并按公式:C/μmol/L=6.45(A532-A600)-0.56A450算出MDA濃度。1.7關(guān)于溶解藻類的方法對溶藻液用0.2μm的濾膜過濾2次,取濾液,并測試其有無活菌生長。確定該濾液無菌后,重復(fù)液體溶藻試驗(yàn)。2結(jié)果與分析2.1細(xì)菌生長曲線cm23的測定如圖1所示,細(xì)菌DC23的遲緩期很短,小于0.5h,約10h左右就進(jìn)入穩(wěn)定期。2.2藻細(xì)胞溶藻檢測在液體溶藻試驗(yàn)中,DC23對M.aeruginosa,M.wessenbergii,M.viridis,Scenedesmus和Aphanizomenon均有很強(qiáng)的溶解作用,尤其是對M.wessenbergii,12h即可見溶藻效果,2d后測葉綠素含量,下降70%左右。選用該細(xì)菌的不同濃度梯度(103—1010個/mL)做溶藻試驗(yàn),當(dāng)DC23在103—105個/mL時,溶藻現(xiàn)象不明顯;當(dāng)DC23在105—1010個mL時,溶藻現(xiàn)象明顯,且初始濃度越大,溶藻效果越顯著,溶藻時間越短。顯微鏡下可觀察到藻細(xì)胞凝聚或藻細(xì)胞碎片成團(tuán)存在的地方,聚集較多的溶藻菌DC23。該菌導(dǎo)致藻細(xì)胞凝聚之后,繼續(xù)保持溶解藻細(xì)胞的特性,凝聚的細(xì)胞會進(jìn)一步溶解、破碎。固體溶藻試驗(yàn)的效果不明顯,DC23對M.aeruginosa.和Scenedesmus基本上無溶解現(xiàn)象,但M.wessenbergii在一周后有變黃的現(xiàn)象。水槽溶藻試驗(yàn):從滇池集藻區(qū)取水樣倒入玻璃水槽中,藻液葉綠素的初始濃度為0.6668μg/mL左右。試驗(yàn)現(xiàn)象見圖2。從左至右,玻璃水槽的標(biāo)號為1—6號,其中1、3、5號為加菌液的水槽,2、4、6號為未加菌液的水槽;1、2號接通氣泵,3—6號不接通氣泵,但定時攪動水體;3號接入的細(xì)菌接種量為3%左右(108個/mL),5號接入的細(xì)菌接種量為6%左右(108個/mL)。第2d可見溶藻效果,第4d濃綠的藻液或變?yōu)槿榘咨?不通氣),或變?yōu)闇\土黃色(通氣)。圖2(a)為投加菌液后第4d拍攝的照片(1—6號),可明顯看到滇池水華消失的現(xiàn)象。圖2(b)為5號和6號的近照。2.3用藍(lán)色信號效率分析2d后M.wessenbergii已經(jīng)測不出其光合效能,而M.viridis的光合效能下降91%。2.4aeraminso的丙二醛含量接入溶藻菌4d后,測量其丙二醛含量。M.wessenbergii的丙二醛含量由0.0353μmol/g上升為0.07μmol/g,增高了98.3%;M.aeruginosa的丙二醛含量由0.2685μmol/g上升為0.4104μmol/g,增高了52.8%;M.viridis的丙二醛含量由0.4467μmol/g上升為0.6482μmol/g,增高了45%。2.5藻細(xì)胞破碎細(xì)胞顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞的凝聚現(xiàn)象,藻細(xì)胞凝聚處發(fā)現(xiàn)細(xì)菌菌體附在藻細(xì)胞上,而該藻細(xì)胞周圍已出現(xiàn)若干細(xì)胞碎片,推測可能是由于細(xì)菌直接侵入藻細(xì)胞,導(dǎo)致藻細(xì)胞發(fā)生破碎。該菌菌體大于0.2μm,用0.2μm的針頭過濾器過濾后,在平板上測試無活菌生長,用濾液重復(fù)溶藻試驗(yàn),沒有發(fā)現(xiàn)溶藻現(xiàn)象,進(jìn)一步支持了該細(xì)菌是通過與宿主直接接觸的方式來完成溶藻的推斷。3細(xì)菌溶解和微生物的溶解作用溶藻菌對藻細(xì)胞的溶解和對藻生長的抑制,有四種情況:直接接觸溶藻;釋放有毒物質(zhì);非選擇性地殺傷藻細(xì)胞;藻同細(xì)菌競爭有限的營養(yǎng)物質(zhì)失敗。從滇池分離的溶藻菌DC23是屬于直接接觸溶藻的類型,它的純培養(yǎng)液對藻有很強(qiáng)的溶解作用,而過濾液則不起溶解效果。細(xì)菌DC23的溶藻方式與Mitsutani,ImaiI分別報(bào)道噬胞菌(Cytophagasp.A5Y和J18/M01)一致,這兩種細(xì)菌的培養(yǎng)物對硅藻有強(qiáng)烈的溶解作用,但過濾液不起任何作用。YokoYamamoto和KenjiSuzuki從土壤中分離一株柱狀的G-細(xì)菌MY-1,亦通過直接接觸溶藻的方式溶解藻細(xì)胞,但它們只對固體培養(yǎng)的藍(lán)藻具有很強(qiáng)的溶解作用,而在液體培養(yǎng)基中很難生長,不能達(dá)到溶藻的效果。細(xì)菌DC23與之相反,對于液體培養(yǎng)的藍(lán)藻有很強(qiáng)的溶解作用,但對于固體培養(yǎng)下的藻很少或沒有溶解現(xiàn)象。推測可能由于DC23在液體中細(xì)菌能夠快速運(yùn)動,容易擴(kuò)散,故能夠較快地溶解藻細(xì)胞,而在固體中運(yùn)動比較困難,不易擴(kuò)散,影響了溶藻菌入侵藻細(xì)胞的能力和速度的緣故。該菌在液體培養(yǎng)基中具有很強(qiáng)的溶藻能力,它能導(dǎo)致藻種葉綠素含量的下降,光合效能的急劇降低,以及丙二醛含量的大幅度增高。細(xì)菌對藻的溶解作用與其初始濃度及生長速度有一定關(guān)系。彭超等報(bào)道的M6、M8和M1溶藻的濃度下限分別為:105個/mL、106個/mL、105個/mL,且當(dāng)溶藻菌的初始濃度越大,溶藻效果越突出,而低于溶藻下限時,溶藻現(xiàn)象延遲或不明顯。筆者所采用的溶藻菌DC23,當(dāng)其初始濃度在103—105個/mL時,溶藻現(xiàn)象不明顯,但當(dāng)其初始濃度在105