食品中的樣品前處理技術(shù)

近年來，食品安全隱患日益突出。由于食品中有毒有害物質(zhì)嚴重危害人民的健康,世界各國均在積極制定相關(guān)的法令政策,并研發(fā)更為快速、準確、靈敏的檢測方法。然而食品樣品的基體和組成相當復雜,且被分析物處于痕量狀態(tài),需要富集才能被檢出,測定時往往又存在相互干擾,這都給分析測試造成了困難。因此樣品前處理方法已成為食品安全分析中一個十分重要的環(huán)節(jié),是濃縮痕量組分、提高方法的靈敏度以及除去干擾物質(zhì)的重要手段。樣品前處理過程不僅直接影響分析的速度、靈敏度和準確度,還會影響分析儀器的使用壽命。理想的樣品處理和制備技術(shù)應能最大限度地除去干擾物質(zhì),不用或少用溶劑,回收率高,成本低,易操作,效率高,有選擇性,以及適合于寬范圍的樣品種類。傳統(tǒng)的樣品前處理技術(shù)包括液-液萃取、蒸餾、結(jié)晶、過濾、預沉淀、離心、吸附、索氏提取等。其普遍存在的問題是:回收率低、樣品用量大、使用的有機溶劑多,并且操作復雜、費時,有時甚至會使分析物分解或損失,所以都不盡理想。而多種新型固相萃取(SPE)的新方法(如固相微萃取(SPME)、攪拌棒吸附萃取(SBSE)、基質(zhì)固相分散萃取(MSPD)、分子印跡固相萃取(MISPE)、免疫親和固相萃取(IASPE)、整體柱固相萃取(monolithicSPE)、碳納米管固相萃取(CNT-SPE)等是近年來發(fā)展起來的新型樣品前處理方法。本文就這些樣品前處理技術(shù)在食品分析中的應用作一綜述,并對其發(fā)展前景作了展望。1農(nóng)作物殘留污染食品中常見的有毒有害物質(zhì)一般為化學污染物質(zhì),主要包括農(nóng)藥殘留物、獸藥殘留物、自源性污染物、食品添加劑及非法添加物等幾大類。其中農(nóng)藥是指對于昆蟲、病菌及有毒的動植物或動物的外寄生蟲有防治、破壞、引誘、排拒、控制的所有物質(zhì)。施用農(nóng)藥后,在糧、油、蔬菜、水果及禽畜產(chǎn)品上存在的農(nóng)藥及其衍生物以及具有毒理學意義的雜質(zhì)等稱為農(nóng)藥殘留。農(nóng)藥殘留對農(nóng)作物的污染主要是由農(nóng)作物生長過程中施加的農(nóng)藥所造成,以受農(nóng)藥污染的農(nóng)作物為飼料喂養(yǎng)的動物組織中同樣存在農(nóng)藥殘留污染問題。常見的農(nóng)藥殘留物主要包括殺蟲劑、除草劑、殺菌劑、熏蒸劑、殺鼠劑和植物生長調(diào)節(jié)劑等幾類,其中尤以殺蟲劑對食品的污染最為嚴重。殺蟲劑主要包括有機磷類、有機氯類、氨基甲酸酯類、沙蠶毒素類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥等。獸藥殘留是指對食用動物用藥后,動物產(chǎn)品的任何食用部分中的原型藥物或/和其代謝產(chǎn)物,包括與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)的殘留。其主要是在動物飼養(yǎng)過程中使用獸藥或非法使用激素等造成對肉類、蛋類、乳制品類以及蜂蜜等食品的污染。常見的獸藥殘留物主要包括抗微生物藥(抗生素和抗菌藥類)、激素及生長促進劑、抗寄生蟲藥和殺蟲劑等。自源性污染物主要指由于食品自身部分變質(zhì)或周圍的生物體變質(zhì)所產(chǎn)生的污染物質(zhì),如食品中的黃曲霉素和其他霉素等。食品添加劑主要指在食品加工和儲存過程中有意加入的物質(zhì),如增味劑、保鮮劑、防腐劑、食品著色劑、香料、色素等。此外還有其他一些非法添加的有害物質(zhì),如三聚氰胺、蘇丹紅等。從樣品前處理的角度,食品大概可以分為瓜果蔬菜、糧食谷物、油料、煙草/茶葉、肉類、乳制品、蜂蜜、蛋類和復雜加工食品等9大類。表1列出了各類食品中常見的污染物質(zhì)及其主要來源。2固相萃取技術(shù)在食品分析中的應用2.1提取率和回收率朱捷等以頂空SPME作為前處理手段,采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用方法測定了牛奶樣品中23種有機氯農(nóng)藥和8種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥。該方法的最低檢出限為0.002~0.2μg/L,回收率為85%~110%,相對標準偏差(RSD)為3%~12%。Blasco等用SPME提取櫻桃、檸檬、桃和橘子中的殺菌劑,比較了動態(tài)和靜態(tài)模式的解吸效果,同時優(yōu)化了固相微萃取-液相色譜(SPME-LC)過程中的解吸作用,發(fā)現(xiàn)靜態(tài)解吸作用的提取率和回收率較高;并采用高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)測定了5種殺菌劑,證明該法可用于測定水果中的極性農(nóng)藥殘留。Hernández-Borges等報道了SPME和不同的在線預濃縮-超敏感毛細管電泳-紫外檢測器聯(lián)用,定量分析蘋果和橙汁中的5種農(nóng)藥殘留,通過對4種不同在線預濃縮方法的比較,發(fā)現(xiàn)反極性去基質(zhì)富集的靈敏度、有效性和重復性最好,檢出限可達3.1μg/L,低于歐盟的最大殘留量(MRLs)的要求。Ishizaki等應用管內(nèi)SPME與高效液相色譜-熒光檢測器聯(lián)用,在線測定了茶葉和干食品中15種多環(huán)芳烴殘留。結(jié)果表明,使用管內(nèi)SPME方法的靈敏度比直接進樣方法高18~47倍。該方法的線性范圍為0.05~2.0ng/mL,檢出限為0.32~4.63pg/mL,回收率大于70%,RSD(n=5)為5.1%~7.6%。Rodrigues等以聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯纖維萃取頭作為萃取材料,用頂空SPME與GC-MS聯(lián)用,測定了牛奶中10種有機磷農(nóng)藥殘留,檢出限為2.16μg/L。2.2固相萃取涂層材料SBSE技術(shù)是在SPME技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展的一種無溶劑或少溶劑的樣品前處理方法,克服了SPME容量不足的缺點。SBSE一般是在內(nèi)封磁芯的玻璃管上涂覆一層聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)或套上一定厚度的PDMS硅橡膠管制成。萃取時,攪拌棒在完成攪拌的同時吸附目標物,可避免SPME中攪拌子對目標物的競爭吸附。SBSE的固定相體積比SPME的固定相體積大50倍以上,因此富集倍數(shù)相應提高,適合于樣品中超痕量組分的分析。目前商品化的PDMS涂層是非極性的,對極性有機物的萃取效果不好。為了增加對極性化合物萃取的選擇性,可在其表面進行衍生化,例如通過溶膠-凝膠技術(shù)在PDMS中引入β-環(huán)糊精、二乙烯基苯和聚乙烯醇等。然而,衍生化不僅操作步驟繁瑣,而且會縮短涂層的壽命。最近,Huang等制備了一系列單體混合物,然后將其聚合形成整體柱攪拌棒固相萃取材料。這些材料對極性化合物的萃取效率優(yōu)于PDMS涂層。該研究組還以聚(乙烯基咪唑-二乙烯苯)整體柱材料作為攪拌棒固相萃取涂層材料,對牛奶中5種磺胺類藥物殘留進行了HPLC分析,加標樣品的最低檢出限和定量限分別為1.30~7.90ng/mL和4.29~26.3ng/mL,平均回收率為83%~99%,RSD(n=3)為1.3%~13%。近年來一些新的涂層材料例如聚(酞醚砜酮)、聚二甲基硅氧烷/聚吡咯、聚氨酯以及基于限進介質(zhì)和分子印跡聚合物的涂層材料也已被用于攪拌棒固相萃取。這些涂層材料的多孔結(jié)構(gòu)提供了較大的比表面積,從而加大了萃取效率。聚氨酯涂層材料還能提高萃取材料的熱穩(wěn)定性。與PDMS涂層材料相比,這些材料對極性化合物具有更高的選擇性,并能更快達到吸收平衡[14,15,16,17,18,19,20]。林福華等以聚(N-乙烯基咪唑-二乙烯基苯)整體材料為涂層的SBSE技術(shù)富集目標物,并與HPLC聯(lián)用測定水樣品中的雙酚A、辛基酚、壬基酚等烷基酚類污染物。在最佳條件下,3種目標化合物的線性范圍為1.0~200μg/L,檢出限為0.13~0.66μg/L,定量限為0.44~2.19μg/L。Blasco等分別將SBSE和SPME與LC-MS聯(lián)用,測定了蜂蜜中的6種農(nóng)藥殘留。SBSE-LC-MS方法的最低檢出限為0.04~0.4mg/kg,RSD為5%~9%;而SPME-LC-MS方法的最低檢出限為0.8~2mg/kg,RSD為3%~10%。Demyttenaere等對比了SBSE與SPME在威士忌酒分析中的不同,實驗證明SBSE技術(shù)的靈敏度和重現(xiàn)性比SPME更好。2.3固相分散法提取農(nóng)藥殘留MSPD是一種兼具了SPE的優(yōu)點,而在操作上比SPE更簡單的技術(shù),其提取、凈化過程能一步完成,同時可減少樣品損失。MSPD由美國Louisiana州立大學的Barker教授首先提出,它可同時分散和萃取固體、半固體樣品。MSPD集傳統(tǒng)的試樣前處理中所需的試樣均化、組織細胞裂解、提取、凈化等過程為一步,避免了這些過程可能造成的待測物損失,是一種簡單高效的提取凈化方法。MSPD所用的樣品和溶劑量明顯少于液-液萃取。MSPD常用硅藻土、硅膠、Florisil、C18或C8鍵合硅膠、硅酸鎂、活性炭等作為凈化固定相,以二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇等作洗脫劑。該方法適用于各種分子結(jié)構(gòu)和極性農(nóng)藥殘留的提取凈化,尤其適合單一或一類化合物的分離,近年來已在果蔬、乳制品、動植物組織、蛋、脂肪、水產(chǎn)品、橄欖和橄欖油等樣品中的農(nóng)藥殘留檢測中得到廣泛的應用]。但這種技術(shù)的缺點是難以實現(xiàn)自動化,對脂肪含量高的樣品經(jīng)常需要多次凈化處理才能進行分析,因此非常耗費時間。Kristenson等用微量自動基質(zhì)固相分散法提取柑橘中的有機磷、擬除蟲菊酯類殺蟲劑,萃取物可以不經(jīng)后續(xù)凈化而直接進行GC-MS分析。該方法僅需25mg樣品和100μL有機溶劑,檢出限為4~90μg/kg,回收率為83%~118%,RSD為10%~13%。他們也用同樣的方法測定了蘋果、梨和葡萄中的有機磷、擬除蟲菊酯類殺蟲劑,得到了較好的結(jié)果。Torres等以C18鍵合硅膠和石墨化炭黑作為吸附劑,利用MSPD對蘋果、橘子、梨、西紅柿、卷心菜和紅辣椒中的甲基毒死蜱、抑霉唑等13種殺菌劑和殺蟲劑殘留進行了GC-MS分析,發(fā)現(xiàn)采用C18鍵合硅膠作吸附劑的MSPD萃取結(jié)果優(yōu)于石墨化炭黑,而且較好地保留了非極性農(nóng)藥,回收率為70%~105%,檢出限為5~50μg/kg。Fernández等分別以鍵合C18、C8、氰基、氨基和苯基的硅膠作為吸附劑,利用MSPD對橘子、葡萄、洋蔥和西紅柿中的13種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留進行了LC-MS檢測,平均回收率為64%~106%,檢出限為0.001~0.01mg/kg(RSD為5%~15%),是歐盟MRLs的1/10~1/100。Muccio等以Florisil為吸附劑,利用MSPD對草莓、蘋果和橘子中的14種擬除蟲菊酯類殺蟲劑殘留進行提取凈化,使用輕石油醚-二氯甲烷(75∶25,v/v)溶液進行淋洗,避免了其他分離方法中經(jīng)常出現(xiàn)的乳化現(xiàn)象,最后用氣相色譜-電子捕獲檢測器(GC-ECD)進行檢測,平均回收率為80%~115%,RSD為0.5%~5.3%。奉夏平等優(yōu)化了影響MSPD效果的各種因素,選擇Florisil、Alumina為上層填料,C18鍵合硅膠、石墨化炭黑為下層填料,樣品和填料的體積比為1∶2,20mL乙酸乙酯為洗脫液,采用GC-ECD和氣相色譜-火焰光度檢測器(GC-FPD)同時測定蔬菜、水果中的11種有機氯農(nóng)藥、5種擬除蟲菊酯農(nóng)藥和15種有機磷農(nóng)藥殘留,31種農(nóng)藥的回收率為80.4%~112.7%,RSD小于10%,結(jié)果與行業(yè)標準方法測定結(jié)果一致,表明該方法適用于新鮮蔬菜、水果樣品的農(nóng)藥殘留分析。2.4分子印跡聚合物mispe-pe和壓縮劑近年來分子印跡固相萃取方法越來越多地應用于食品中殺蟲劑、藥物殘留、風味物質(zhì)以及添加劑等化合物的富集、分離與檢測。Chapuis等報道了以特丁津和莠滅凈為模板分子,采用低溫紫外引發(fā)制備印跡聚合物的方法。采用裝填了3mL該聚合物的固相萃取柱能從葡萄汁中選擇性地萃取三嗪及其代謝物,達到了與免疫親和柱相當?shù)姆蛛x、凈化、富集效果。Tamayo等以硅膠為犧牲載體合成了分子印跡聚合物:選用異丙隆和利谷隆為模板分子,甲基丙烯酸(MAA)和三氟甲基丙烯酸(TFMAA)為功能單體,向其中加入乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、偶氮二異丁腈(AIBN)、無水甲苯和硅膠,劇烈搖動使預聚合混合物滲透至硅膠孔內(nèi),再通過熱引發(fā)制備聚合物,然后用3mol/LNH4HF2水溶液刻蝕洗去硅膠,最后用甲醇抽提除去模板分子。該聚合物可直接用于檢測蔬菜樣品中的苯基脲類除草劑,檢出限可達0.1μg/g。Schirmer等以氯霉素為模板分子,MAA為功能單體,EDMA為交聯(lián)劑,AIBN為引發(fā)劑,氯仿為溶劑,在60℃下引發(fā)反應制得分子印跡聚合物。用該聚合物裝填的固相萃取柱對蜂產(chǎn)品中氯霉素進行富集,并用反相液相色譜(RPLC)定量分析,檢出限可達0.1μg/mL,回收率大于90%。Baggiani等以有孔氯甲基化聚苯乙烯為基質(zhì),MAA為功能單體,EDMA為交聯(lián)劑制備印跡聚合物,將其作為固相萃取柱的填料分離富集紅酒中的殺菌劑嘧霉胺,并進行HPLC分析。該方法能選擇性地檢測出嘧霉胺和嘧啶胺殺菌劑,而非嘧啶胺類殺菌劑及其類似物均未檢出。其檢出限達到0.1μg/mL,回收率為80%~90%。Guzmán-VázquezdePrada等發(fā)展了一種在線MISPE方法選擇性地富集牛奶中痕量的磺胺甲基嘧啶,并用伏安法進行檢測。這種方法的濃縮因子為45,平均回收率為97%~103%,RSD為2.8%,其檢出限低于國際食品法典委員會(CodexAlimentariusCommission)標準規(guī)定的最大殘留量25μg/L。Puoci等建立了從食品中預富集痕量蘇丹紅I的MISPE方法,證明在HPLC方法無法檢測到時,利用MISPE可以有效地對其進行檢測。Maier等用MISPE方法檢測紅酒中的致癌物質(zhì)毒汁菌素赭曲霉素,結(jié)果發(fā)現(xiàn)非分子印跡聚合物(NMIPs)與MIPs對模板分子具有類似的選擇性,因而能夠用NMIPs代替MIPs作為SPE的吸附劑,避免了模板分子流出的問題。Zhou等應用在線分子印跡固相萃取脈沖洗脫,結(jié)合熒光檢測方法,快速檢測小麥中的赭曲霉素A,5min內(nèi)即可完成整個分析過程。除此之外,MISPE-PE(脈沖洗脫)與LC-MS聯(lián)用可以實現(xiàn)赭曲霉素A的快速定性和定量分析。周文輝等以三聚氰胺為模板分子合成了分子印跡聚合物。以該分子印跡聚合物填充的固相萃取小柱可以從奶粉、純牛奶等奶制品中選擇性地分離、富集三聚氰胺,有效地去除了奶制品中的復雜基質(zhì)干擾。對奶粉和液態(tài)奶提取液的加標回收率分別為91%~103%和93%~98%,RSD(n=3)分別為7.9%和1.1%。2.5抑霉唑roWatanabe等將抑霉唑單克隆抗體固定到CNBr-活性瓊脂糖凝膠上制成一種免疫親和凈化柱,用于提取凈化柑橘類水果中的抑霉唑。這種免疫親和凈化柱每根至少可重復用3次,能有效去除干擾雜質(zhì),從萃取到HPLC檢測僅需1h,加標回收率為85%~99%,RSD為1.8%~6.6%。該方法具有快速、無樣品基質(zhì)干擾、對分析人員和環(huán)境無污染的優(yōu)點,有望在農(nóng)藥多殘留分析領(lǐng)域有更多的發(fā)展。2.6整體柱的高效轉(zhuǎn)化應用Shintani等將C18鍵合硅膠整體柱引入管內(nèi)SPME與HPLC在線聯(lián)用技術(shù)中。實驗表明,在5~50μL/min的流速范圍內(nèi),整體柱對聯(lián)苯的吸附容量基本保持不變,柱壓變化也僅在20~24bar之間。用該方法檢測水樣中的殺蟲劑,檢測靈敏度較毛細管LC提高了50倍。分子印跡聚合物整體柱也被用于樣品的預富集。Zhang等以神經(jīng)酰胺Ⅲ為模板分子,苯乙烯、甲基丙烯酸縮水甘油酯和甲基丙烯酸為單體,二乙烯基苯和三烯丙基異氰酸酯為交聯(lián)劑,在150mm×4.6mm的不銹鋼柱管中制備了分子印跡整體柱,并嘗試將其用于酵母提取液中神經(jīng)酰胺類物質(zhì)的提純和富集,證明了分子印跡整體柱在樣品預處理中的應用潛力。Eisert等設(shè)計了管內(nèi)SPME與HPLC在線聯(lián)用的裝置。他們把萃取柱和分離柱都連接到一個六通閥上,將一定量的樣品在注射泵或機械泵的驅(qū)動下加入到萃取柱中進行萃取,然后將閥旋轉(zhuǎn)到進樣的位置,此時HPLC的流動相將富集在萃取柱上的分析物洗脫下來,并帶入到分離柱中進行分析。Huang等開發(fā)了一種新型的聚合物整體柱微萃取(PMME)裝置,用PMME-LC-MS聯(lián)用測定了蜂蜜、牛奶和雞蛋中氯霉素的藥物殘留。加標回收率為85%~102%,RSD為2.1%~8.9%,檢出限為0.02~0.04ng/mL。相對于硅膠基質(zhì)的整體柱而言,有機聚合物整體材料表現(xiàn)出更好的生物相容性和穩(wěn)定性。Nie等將有機聚合物整體柱引進管內(nèi)SPME與HPLC在線聯(lián)用技術(shù)中。在150mm×250μm的毛細管中,以甲苯/十二醇為致孔劑,用熱引發(fā)自由基共聚甲基丙烯酸-乙烯基二甲基丙烯酸酯,制備了聚(甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯)毛細管整體柱。采用雙六通閥雙泵系統(tǒng),將毛細管整體柱同常規(guī)的C18鍵合硅膠柱聯(lián)用,對雞蛋中的氟喹諾酮類物質(zhì)、牛奶中的磺胺類、魚肉中的四環(huán)素類抗生素以及生物組織中的血管緊縮素Ⅱ受體拮抗劑等進行了萃取和檢測,檢出限為ng/mL級,RSD小于10%。Baryla等在毛細管進口端用光引發(fā)聚合制備了聚甲基丙烯酸酯整體柱,并用于在線富集心得安。他們首先將樣品注入毛細管,用水將沒有結(jié)合的樣品從毛細管中沖出,然后在毛細管兩端加上負電壓以產(chǎn)生反向電滲流,驅(qū)動分離/解吸所需的緩沖溶液填滿毛細管;隨后將負電壓切換為正電壓,對分析物進行分離和檢測。實驗結(jié)果表明,用這種預富集方法可以使檢出限達到nmol級,比傳統(tǒng)的毛細管電泳-紫外檢測(CE-UV)的檢出限降低了3個數(shù)量級。2.7在線性關(guān)系、保鮮、提取藥物和試劑Katsumata等將50mg多壁碳納米管作為吸附劑裝入玻璃固相萃取柱中,用于富集有機磷農(nóng)藥二嗪磷,獲得了滿意的結(jié)果。該研究組還將多壁碳納米管做成多壁碳納米管盤(MWCNTsdisc),分離和富集有機磷殺蟲劑二嗪農(nóng)以及農(nóng)藥莠去津和西瑪津,用GC-MS分離檢測。該方法的線性范圍為0.1~1ng/mL,檢出限為2.5~5pg/mL,RSD為3%~7%。Wang等將分析物經(jīng)超聲萃取和多壁碳納米管萃取濃縮、凈化后,經(jīng)GC-MS進行分離檢測,建立了測定豬肉中4種苯二氮類藥物的方法。該方法的線性范圍為20~1000ng/mL,檢出限為2~5μg/kg,平均加標回收率為75%~104%,RSD為1.3%~10%。隨后,該研究組還以多壁碳納米管作為SPE吸附劑,與GC-MS/MS聯(lián)用測定了豬肉中3種巴比妥藥物的殘留。該方法的線性范圍和檢出限分別為0.5~50μg/kg和0.1~0.2μg/kg,加標回收率為75%~96%,RSD為2.1%~7.8%。Ravelo-Pérez等以多壁碳納米管作為SPE吸附劑和GC聯(lián)用測定了蘋果、葡萄、橘子和鳳梨果汁中的8種有機磷農(nóng)藥殘留,回收率為73%~103%,方法的檢出限為1.85~7.34μg/kg,RSD小于8.5%。他們指出多壁碳納米管作為SPE吸附材料的優(yōu)勢在于:(1)進行SPE前僅需將樣品用水稀釋并將pH調(diào)至6.0,無需復雜的處理過程;(2)吸附劑用量少;(3)萃取效率和選擇性高,色譜分離時無雜質(zhì)干擾;(4)SPE成本低,快速,簡單,并可同時萃取多個樣品。Fang等以多壁碳納米管為SPE吸附劑,采用在線自動化SPE-HPLC聯(lián)用技術(shù)同時測定了雞蛋和豬肉中的10種磺胺類藥物殘留。該方法的檢出限為4.1~10ng/L,RSD為2.5%~7.8%,整個測定只需要35min