青枯雷爾氏菌脂肪酸分布的氣相色譜分析

0青枯雷爾氏菌種下分化研究[研究意義]細(xì)菌綠枯病是由綠枯萎雷土（ralstoniasona）引起的毀滅性土壤傳播疾病。青枯雷爾氏菌可危害44個科300多種植物，造成農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)巨大經(jīng)濟(jì)損失，是福建省內(nèi)許多作物上發(fā)生的毀滅性病害。青枯雷爾氏菌在寄主范圍、地理分布、致病特征、流行特征、種下分化等方面存在較大的差異，具有明顯的多態(tài)性?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】青枯雷爾氏菌的種下分化復(fù)雜，前人從生理小種（race）、生化型（biovar）、血清型（serotype）、溶源型（lysotype）、基因型（genetype）等方面對種下分化進(jìn)行研究。生理小種依據(jù)青枯雷爾氏菌在鑒別寄主上的致病性進(jìn)行分類，但是姚革等應(yīng)用該方法分析了四川省青枯雷爾氏菌的菌系及其分布，結(jié)果表明，同一生理小種中存在著不同的致病類型菌株。按對3種雙糖和3種六碳醇的利用情況，將青枯雷爾氏菌分為不同的生化型。這種分類主要體現(xiàn)在青枯雷爾氏菌的地理分布和種群進(jìn)化上。王國平等分析了湖南省煙草青枯雷爾氏菌的生化型，認(rèn)為青枯雷爾氏菌致病力的強(qiáng)弱與生化型沒有直接的相關(guān)性。用血清型、溶源型、基因型分析，操作復(fù)雜，仍不能解決致病力分化問題。脂肪酸是生物體內(nèi)不可缺少的能量和營養(yǎng)物質(zhì)，是生物體的基本結(jié)構(gòu)成分之一，在細(xì)胞中絕大部分脂肪酸以結(jié)合形式存在，構(gòu)成具有重要生理功能的脂類，它是構(gòu)成生物膜的重要物質(zhì)；是有機(jī)體代謝所需燃料的貯存形式；作為細(xì)胞表面物質(zhì)與細(xì)胞識別、種族特異性和細(xì)胞免疫等有密切關(guān)系。脂肪酸和細(xì)菌的遺傳變異、毒力、耐藥性等有極為密切的關(guān)系。細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中普遍含有的脂肪酸成分與細(xì)菌的DNA具有高度的同源性，各種細(xì)菌具有其特征性的細(xì)胞脂肪酸指紋圖譜。目前，國內(nèi)外已有把脂肪酸用于細(xì)菌鑒定的報道。由于青枯雷爾氏菌存在著復(fù)雜的種下分化，研究其脂肪酸的多態(tài)性并分析它與青枯雷爾氏菌現(xiàn)有種下分化方法的關(guān)系將具有重要的意義?！颈狙芯康那腥朦c】因此，可以分析青枯雷爾氏菌脂肪酸的多態(tài)性分布；對青枯雷爾氏菌的脂肪酸進(jìn)行聚類分析；并分析青枯雷爾氏菌脂肪酸與其生理小種、生化型和致病性之間的關(guān)系。【擬解決的關(guān)鍵問題】擬通過氣相色譜技術(shù)快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢出青枯雷爾氏菌細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸，分析其脂肪酸分布的多態(tài)性，初步探討將脂肪酸應(yīng)用于青枯雷爾氏菌種下分化的可行性。1材料和方法1.1青枯雷爾氏菌的分離純化從福建省經(jīng)濟(jì)作物番茄、茄子、辣椒和生姜青枯病嚴(yán)重發(fā)生的田塊采集植株樣本，參照方中達(dá)的方法，用2,3,5-氯化三苯基四氮唑培養(yǎng)基（簡稱TTC）培養(yǎng)基分離純化，得到40株青枯雷爾氏菌，保存于20～25℃的無菌水中，備用。菌種來源見表1ㄢ1.2青枯來年測定氨基酸含量的氣色譜分析1.2.1試劑：脂+1l水TSBA培養(yǎng)基：30g胰蛋白胨大豆肉湯（Trypticsoybroth,TSB）+15g瓊脂+1L水（TSB購于Fisher公司）。皂化試劑：氫氧化鈉45g+甲醇150ml+水150ml。甲基化試劑：6N鹽酸325ml+甲醇275ml。萃取試劑：正已烷200ml+甲基叔丁基乙醚200ml。洗滌試劑：氫氧化鈉10.8g+水900ml。（配制方法由MIDI公司提供）1.2.2樣品的制備(1）細(xì)菌培養(yǎng)條件：TSBA平板培養(yǎng)基，四線劃線法，培養(yǎng)溫度（28±1）℃，培養(yǎng)時間（24±2)h;(2）獲菌：用接種環(huán)挑取3～5環(huán)（約40mg濕重）的菌落置入一個干凈、干燥的有螺旋蓋的試管中（最佳的獲菌區(qū)域為第3區(qū)）；(3）皂化：加入（1.0±0.1)ml皂化試劑，擰緊蓋子，振蕩5～10s，放入95～100℃的沸水中5min，室溫冷卻，振蕩5～10s，再水浴25min，室溫冷卻；(4）甲基化：開蓋加入（2.0±0.1)mL甲基化試劑，擰緊蓋子，振蕩5～10s，(80±1）℃水浴10min，移開且快速用流動自來水冷卻至室溫；(5）萃?。杭尤耄?.25±0.1)ml的萃取試劑，擰緊蓋子，溫和混合旋轉(zhuǎn)10min，打開管蓋，利用干凈的移液管取出每個樣本的下層水相部分；(6）基本洗滌：加入（3.0±0.2)ml洗滌試劑，擰緊蓋子，溫和混合旋轉(zhuǎn)5min，打開管蓋，利用干凈的移液管移出約2/3體積的上層有機(jī)相到干凈的氣相色譜檢體小瓶，用于氣相檢測。1.2.3his防治新技術(shù)氣相色譜系統(tǒng)采用的是美國Agilent6890N型，包括全自動進(jìn)樣裝置、石英毛細(xì)管柱及氫火焰離子化檢測器；分析軟件應(yīng)用美國MIDI公司開發(fā)的基于細(xì)菌細(xì)胞脂肪酸成分鑒定細(xì)菌的軟件SherlockMIS4.5(microbialidentificationsystem）和LGS4.5(librarygenerationsoftware）。在下述色譜條件下平行分析脂肪酸甲酯混合物標(biāo)樣和待檢樣本：二階程序升高柱溫，170℃起始，5℃/min升至260℃，而后40℃/min升溫至310℃，維持90s；汽化室溫度250℃、檢測器溫度300℃；載氣為氫氣（2ml·min-1）、尾吹氣為氮氣（30ml·min-1）；柱前壓l0.00psi(1psi=6.895kPa）；進(jìn)樣量lμl，進(jìn)樣分流比100﹕l。1.3青枯來爾菌脂肪酸的多態(tài)性分析1.3.1青枯雷爾氏菌脂肪酸檢測選擇青枯病發(fā)生嚴(yán)重的茄科植物番茄作為供試寄主，將由分別采自福州北峰、福州農(nóng)大和福州建新的番茄青枯病樣本中分離到9株青枯雷爾氏菌作為研究對象，按與1.2相同方法提取脂肪酸和進(jìn)行檢測，分析它們的脂肪酸的種類與主要脂肪酸含量的差異。1.3.2青枯雷爾氏菌檢測脂肪酸的種類和主要脂肪酸的檢測方法選擇從不同的發(fā)病植物番茄、辣椒、生姜和茄子上分離的4株青枯雷爾氏菌作為供試菌株，按方法1.2提取脂肪酸和進(jìn)行檢測，分析它們的脂肪酸的種類與主要脂肪酸含量的差異。1.3.3脂肪酸檢測及聚類分析對分離的40株青枯雷爾氏菌（表1）按與1.2相同的方法提取脂肪酸和進(jìn)行檢測，利用LGS軟件對40株青枯雷爾氏菌脂肪酸色譜結(jié)果進(jìn)行聚類分析，得出系統(tǒng)樹圖（Dendrogram）并進(jìn)行分類，分析聚成的各類的脂肪酸特點及主要差別。1.3.4青枯雷爾氏菌生理鑒定方法用TTC平板培養(yǎng)基將保存在20～25℃無菌水中的菌株劃線培養(yǎng)48h，配成2×109cfu/ml菌懸液，采用剪葉接種法，在鑒別寄主茄子（5～7葉期）、香蕉（6～9葉期）上接種，用清水接種為對照，接種后置于28～30℃的人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，逐日觀察植株的癥狀表現(xiàn)。按Buddenhagen等提出的青枯雷爾氏菌生理小種的鑒定方法進(jìn)行分類，采用排除法，即若不能侵染香蕉則非生理小種2，若可侵染茄子則非生理小種3。比較青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性與其生理小種之間是否存在相對應(yīng)的關(guān)系。1.3.5菌株生化型的確定在TTC平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)青枯雷爾氏菌單細(xì)胞菌落，用接種針挑取單細(xì)胞菌落，接種于分別含有乳糖、麥芽糖、纖維二糖、甘露醇、山梨醇和甜醇的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基里（由杭州天和微生物試劑有限公司提供），置于28～30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察供試菌株對3種雙糖和3種6碳醇的利用情況，確定40株菌株的生化型。比較青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性與其生化型之間是否存在相對應(yīng)的關(guān)系。1.3.6菌株致病性的確定在TTC平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)青枯雷爾氏菌單細(xì)胞菌落，按照劉波等建立的弱化指數(shù)的測定方法，測定40株供試菌株的弱化指數(shù)（N=D1/D2，其中N為弱化指數(shù)，D1和D2分別表示在TTC平板培養(yǎng)基上青枯雷爾氏菌細(xì)胞單菌落的紅斑半徑和菌落半徑）。同時進(jìn)行番茄組培苗回接，每個菌株回接30株組培苗，設(shè)清水對照，將回接的組培苗放置于28～30℃的人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，10d后觀察發(fā)病率。根據(jù)弱化指數(shù)和回接發(fā)病率，確定其致病類型，菌株的致病性區(qū)間劃分如下：弱化指數(shù)<0.60時，菌株回接發(fā)病率為100%，定義為強(qiáng)致病力菌株；弱化指數(shù)>0.80時，菌株回接發(fā)病率為0，定義為無致病性菌株；弱化指數(shù)介于0.60和0.80之間的，菌株的致病性為不確定性，定義為過渡性菌株。比較青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性與其致病性之間是否存在相對應(yīng)的關(guān)系。2結(jié)果與分析2.1脂肪酸的含量分析從番茄發(fā)病植株上分離的9株青枯雷爾氏菌脂肪酸色譜圖，得出：色譜峰的數(shù)量（脂肪酸種類）和3種主要脂肪酸的含量存在著顯著性差異（表2）。各個菌株脂肪酸的種類多的可達(dá)到21種（Rs-T.1.3-010702-01、Rs-T.1.3-010702-02），少的只有13種（Rs-T.1.3-010702-04），差異較大；在供試的9株菌中，3種主要脂肪酸（C16﹕1ω7c/C15﹕0ISO2OH、C16﹕0和C18﹕1ω7c）所占的總百分比含量為總脂肪酸的69.65%到81.18%；同時，這3種主要的脂肪酸的含量也存在著明顯的不同：C16﹕1ω7c/C15﹕0ISO2OH在菌株Rs-T.1.3-010702-03的總脂肪酸中占32.73%，而在菌株Rs-T.1.3-010702-07中只有23.55%；在菌株Rs-T.1.3-010702-01的總脂肪酸中，C16﹕0的含量高達(dá)32.96%，而在菌株Rs-T.1.3-010702-02中僅占23.49%；C18﹕1ω7c的最高含量為23.52%（Rs-T.1.3-010702-03），最低含量為12.89%（Rs-T.1.3-010702-01）ㄢ2.2脂肪酸的構(gòu)成及含量分析從不同的發(fā)病植物番茄、辣椒、生姜和茄子上分離的4株青枯雷爾氏菌的脂肪酸色譜圖，它們之間的差異見表3。Rs-T.1.3-010702-01脂肪酸的種類為21種，Rs-E.1.3-010719-01只有12種。在供試的4株菌中，C16﹕1ω7c/C15﹕0ISO2OH、C16﹕0和C18﹕1ω7c都為主要脂肪酸，所占的總百分比含量為總脂肪酸的70.52%～78.23%；同時，C16﹕1ω7c/C15﹕0ISO2OH在Rs-E.1.3-010719-01的脂肪酸總量中占30.88%，而在Rs-T.1.3-010702-01中只占25.52%；在Rs-T.1.3-010702-01中，C16﹕0的含量高達(dá)32.96%，在Rs-P.1.4-010704-01中是25.55%；C18﹕1ω7c的最高含量為22.02%（Rs-P.1.4-010704-01），最低含量為12.89%（Rs-T.1.3-010702-01）。2.3脂肪酸分布特點利用LGS軟件對40株青枯雷爾氏菌脂肪酸色譜結(jié)果進(jìn)行聚類分析，系統(tǒng)樹圖（dendrogram）見圖1?；贚GS軟件，樣品的歐氏距離（euclidiandistance，λ）在10或以下時為同一種菌（species）；當(dāng)λ=6時，表示同一種的不同類群。從圖1可以看出，當(dāng)λ=6.00時，40株青枯雷爾氏菌分成3個類群，可用groupⅠ、Ⅱ、Ⅲ表示。GroupⅠ包含了菌株Rs-T.1.3-010702-26、Rs-T.1.3-010702-12、Rs-T.1.3-010702-11、Rs-T.1.3-010702-16;GroupⅡ包含了菌株Rs-T.1.3-010702-05、Rs-T.1.3-010702-15、Rs-T.1.3-010702-23、Rs-T.1.3-010702-09、Rs-T.1.3-010702-10、Rs-T.1.3-010702-22、Rs-T.1.3-010702-24、Rs-T.1.3-010702-13、Rs-P.1.4-010704-01、Rs-E.1.3-010620-05、Rs-T.1.3-010702-04、Rs-E.1.3-010709-01、Rs-T.1.3-010702-28、Rs-T.1.1-010615-01、Rs-T.1.3-010702-06、Rs-T.1.3-010702-08、Rs-T.1.3-010702-02、Rs-T.1.3-010702-03、Rs-E.2.1-050914-01;GroupⅢ包含了菌株Rs-E.1.3-020626-02、Rs-G.1.4-010704-01、Rs-E.1.3-020626-03、Rs-E.1.3-020626-04、Rs-T.1.3-010702-14、Rs-T.1.3-010702-20、Rs-P.1.4-010704-02、Rs-T.1.3-010702-18、Rs-T.1.3-010702-01、Rs-T.1.3-010702-19、Rs-T.1.3-010702-07、Rs-T.1.3-010702-21、Rs-T.1.3-010702-17、Rs-T.1.3-010702-25、Rs-T.1.3-010702-27、Rs-T.1.2-010618-01、Rs-G.1.4-010704-02ㄢGroupⅠ、Ⅱ、Ⅲ的典型脂肪酸色譜圖見圖2。3個類群各自的脂肪酸分布特點見表4。3個類群脂肪酸之間的主要差異：（1）平均脂肪酸種類：GroupⅠ最多，有22種，GroupⅡ最少，有17種，GroupⅢ介于兩者之間，有19種。（2）主要脂肪酸的平均含量：3個類群中含量最低的脂肪酸都是C18﹕1ω7c，而在GroupⅢ中其含量（16.23%）明顯的低于其在GroupⅠ（20.21%）和GroupⅡ（21.14%）中的含量；含量最高的脂肪酸，在GroupⅠ和GroupⅡ中是C16﹕1ω7c/C15:0ISO2OH含量最高，在GroupⅢ中則是C16﹕0含量最高；C16﹕1ω7c/C15﹕0ISO2OH和C16:0含量的差值，GroupⅠ（9.01%）明顯大于GroupⅡ（4.54%）。（3）在GroupⅠ中，第3個特征性色譜峰C16﹕1ω7c/C15﹕0ISO2OH和第4個特征性色譜峰C16﹕0之間出現(xiàn)一個小的波峰，而在GroupⅡ和GroupⅢ中則沒有。（4）代表非優(yōu)勢脂肪酸的小波峰，在GroupⅠ中，主要集中在第1個特征性色譜峰C14﹕0和第2個特征性色譜峰C14﹕03OH/C16﹕1ISOⅠ之間以及第4個特征性色譜峰C16﹕0和第5個特征性色譜峰C18﹕1ω7c之間，而在GroupⅡ和GroupⅢ中，只有第4個特征性色譜峰C16﹕0和第5個特征性色譜峰C18﹕1ω7c之間比較多。2.4青枯雷爾氏菌臨床小種類型40株青枯雷爾氏菌生理小種的鑒定結(jié)果見表5。供試的40株菌株均屬于生理小種1，按脂肪酸聚成的3個類群屬于同一生理小種，表明青枯雷爾氏菌生理小種1可以屬于不同的脂肪酸類群。2.5青枯雷爾氏菌聚類規(guī)律供試菌株符合生化型標(biāo)準(zhǔn)的菌株共有29株，不符合生化型標(biāo)準(zhǔn)的有11株，暫定為“新型”，見表6。將生化型測定的結(jié)果進(jìn)行編碼，+為1，-為0，根據(jù)表6的數(shù)據(jù)組建矩陣，以歐氏距離為相關(guān)系數(shù)，用類平均方法進(jìn)行系統(tǒng)聚類，結(jié)果見圖3，當(dāng)λ=1.632時，可將青枯雷爾氏菌分成4個類群，生化型類群1的占22.5%，生化型類群2的占57.5%，生化型類群3的占12.5%，生化型類群4的占7.5%。從表6可以看出，同一生化型類群可以屬于不同的脂肪酸類群，同一脂肪酸類群也可以屬于不同的生化型類群，表明青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性與生化型之間不存在相關(guān)性。2.6回接發(fā)病率測定供試的40株青枯雷爾氏菌的弱化指數(shù)和回接發(fā)病率，結(jié)果見表7。從表中可以看出，GroupⅠ菌株的弱化指數(shù)>0.80，菌株回接發(fā)病率為0，為無致病性菌株；GroupⅢ的弱化指數(shù)<0.60，菌株回接發(fā)病率為100%，為強(qiáng)致病性菌株；GroupⅡ的弱化指數(shù)介于0.60和0.80之間，菌株回接發(fā)病率在6.7%～100%之間變動，為過渡性菌株。表明青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性與致病性之間存在一定的相關(guān)性。GroupⅠ和GroupⅢ的回接發(fā)病率分別為0和100%，而GroupⅡ的回接發(fā)病率在6.7%～100%的區(qū)間內(nèi)變動，這可能與青枯雷爾氏菌在人工培養(yǎng)條件下易發(fā)生致病性變異，致病力會有所下降或消失有關(guān)。3青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性與3種藥物的聚類分析關(guān)系氣相色譜技術(shù)是一種分離效能高、分析速度快、靈敏性及特異性高的分離分析方法，應(yīng)用氣相色譜技術(shù)和SherlockMIS數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)分析青枯雷爾氏菌脂肪酸可通過單次試驗將青枯雷爾氏菌鑒定到種。該方法采用的是高精密的分析儀器，分析對象是可隨生長環(huán)境發(fā)生變化的細(xì)胞脂肪酸成分，因此分析過程的條件選擇和質(zhì)量控制則顯得非常重要，必須對培養(yǎng)基成分、細(xì)菌培養(yǎng)條件、細(xì)菌純化、菌齡、色譜條件等試驗條件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，否則會嚴(yán)重影響方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌鑒定和微生物多樣性研究中，但是對于同一種細(xì)菌脂肪酸多態(tài)性的分析尚未見報道。青枯雷爾氏菌是一個比較復(fù)雜的細(xì)菌，適應(yīng)性強(qiáng)，寄主范圍很廣，可侵害44個科的300多種植物，在寄主范圍、地理分布、致病特征、流行特征、種下分化等方面存在較大的差異，具有明顯的多態(tài)性。青枯雷爾氏菌脂肪酸的氣相色譜顯示青枯雷爾氏菌脂肪酸分布也存在著明顯的多態(tài)性：同一寄主分離的青枯雷爾氏菌脂肪酸分布存在著明顯的差異，不同寄主分離的青枯雷爾氏菌脂肪酸也存在著明顯的不同。青枯雷爾氏菌脂肪酸的種類和主要脂肪酸的含量存在明顯的差異。進(jìn)一步表現(xiàn)了青枯雷爾氏菌的高度復(fù)雜性。青枯雷爾氏菌種下分化復(fù)雜，過去40年，生理小種和生化型的劃分，提供了識別青枯雷爾氏菌的種下分化的主要方法，其它的用于種下分化的方法還有血清型、溶源型、致病型、基因型等等。根據(jù)青枯雷爾氏菌對鑒別寄主的反應(yīng)不同，可以進(jìn)行生理小種的劃分；按對3種雙糖（麥芽糖、乳糖和纖維二糖）和3種六碳醇（甘露醇、山梨醇和甜醇）的利用情況，可將青枯雷爾氏菌分為不同的生化型；根據(jù)青枯雷爾氏菌弱化指數(shù)的不同，可以分成不同的致病性菌株。本試驗證實了青枯雷爾氏菌脂肪酸的多態(tài)性，因此可以對青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性進(jìn)行聚類分析，分析青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性與上述3種種下分化方法之間的關(guān)系。應(yīng)用LGS軟件對所檢測的40株青枯雷爾氏菌脂肪酸進(jìn)行聚類分析，取歐式距離為6時，可以分成3類，即GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ。表明氣相色譜技術(shù)、MIS數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)以及LGS軟件三者的結(jié)合，對青枯雷爾氏菌按脂肪酸多態(tài)性進(jìn)行分類得以實現(xiàn)。如果知道青枯雷爾氏菌菌株的脂肪酸色譜圖，根據(jù)青枯雷爾氏菌脂肪酸色譜圖3類之間的區(qū)別，可以確定它屬于哪一個類群：若青枯雷爾氏菌菌株脂肪酸在C16﹕1ω7c/C15﹕0ISO2OH和C16﹕0之間有一小的色譜峰，則說明它屬于GroupⅠ，否則屬于GroupⅡ或GroupⅢ；如果是后者，再根據(jù)它的C16﹕1ω7c/C15﹕0ISO2OH和C16﹕0兩者百分含量的高低進(jìn)行判斷，如果前者低于后者，則它屬于GroupⅢ，否則屬于GroupⅡ。由于該技術(shù)的快速性、準(zhǔn)確性，并可通過計算機(jī)的運用使分類達(dá)到數(shù)據(jù)化、自動化，因此作為一種重要的化學(xué)分類依據(jù)應(yīng)用在微生物的種下分類