結晶紫-蛋白質復合體系的建立

蛋白質是生物最重要的基本組成成分之一，與營養(yǎng)、免疫、新陳代謝、生命起源和發(fā)育密切相關。因此，蛋白質的定量測定在長壽、臨床醫(yī)學和化學史上發(fā)揮著非常重要的作用。目前蛋白質定量分析的方法很多,主要的有基于染料-蛋白質結合及金屬離子—染料—蛋白質結合的光譜分析法,熒光分析法和共振光散射法等,利用電化學方法研究有機分子與蛋白質相互作用及其分析應用也有報道。結晶紫是一種三苯甲烷類染料,常用作生物染色劑和無機離子的顯色劑。經研究發(fā)現(xiàn)結晶紫具有極譜活性,并且在弱酸性條件下能與蛋白質結合形成一種復合物,使結晶紫的還原峰峰電流降低,因此建立了一種新的測定蛋白質的電化學探針,結果滿意。1實驗部分1.1儀器、試藥和儀器JP-303型極譜分析儀(成都儀器廠),三電極系統(tǒng)。滴汞電極為工作電極,飽和甘汞電極(vsSCE)為參比電極,鉑絲電極為對電級;CV-50W電化學分析儀(美國BAS公司),JM-1型懸汞電極(江蘇電分析儀器廠)為工作電極;pHS-25型酸度計(上海雷磁儀器廠)。牛血清白蛋白(BSA,武漢生命技術有限公司,相對分子質量以65000計):500mg/L,4℃冰箱冷藏;結晶紫(CV)標準溶液:5×10-4mol/L,NaAc-HAc緩沖液:0.2mol/L,實驗用水為三次蒸餾水,所用試劑均為分析純。1.2電化學方法在10mL比色管中,依次加入1.5mL,pH4.5,0.2mol/L的NaAc-HAc緩沖液,1.0mL的5×10-4mol/L的結晶紫溶液和一定量的BSA,用水稀釋至刻度,靜置5min后用電化學方法進行研究和測定。2結果與討論2.1逆還原峰與bsa在pH4.5的NaAc-HAc緩沖液中,結晶紫有一靈敏的不可逆還原峰(圖1曲線1),當加入BSA后,結晶紫還原峰峰電流明顯下降(圖1曲線2)。這說明BSA與結晶紫結合生成一種非電活性復合物,降低了結晶紫在溶液中的濃度,使相應的還原峰峰電流下降。2.2bsa的電化學測定如圖2所示,在pH4.5的NaAc-HAc緩沖液中,用線性掃描一階導數(shù)極譜法對體系進行測定,結晶紫在-0.82V(vsSCE)處有一靈敏一階導數(shù)還原峰,當在溶液中加入一定量的BSA后,峰電位不變而峰電流卻明顯降低,峰電流的降低值同加入的BSA的量在一定范圍內呈線性關系,因此可以用于BSA的電化學測定。2.3試驗條件的選擇2.3.1緩沖劑的選擇試驗了NaAc-HAc,B-R緩沖液,六次甲基四胺等緩沖液對峰電流差值Δip的影響,試驗表明,結晶紫在NaAc-HAc緩沖液中峰形穩(wěn)定且引入BSA后峰電流下降明顯,故選之為緩沖體系。在10mL測定溶液中,0.2mol/LNaAc-HAc緩沖液用量在1.0～3.0mL之間變化時,對Δip的影響不大(圖4),取1.5mL是峰電流最穩(wěn)定,所以本實驗選用NaAc-HAc緩沖液加入量為1.5mL。實驗了pH值對Δip的影響,結果表明pH在4.5時Δip(圖3)最大,本實驗選擇溶液pH4.5。2.3.2結晶紫濃度的影響在pH4.5的NaAc-HAc的緩沖液中,固定BSA濃度為10mg/L,考察結晶紫濃度變化對測定的影響,結果表明,當結晶紫濃度為5×10-5mol/L時,峰電流穩(wěn)定,且峰電流差值Δip(圖5)最大,所以本實驗選擇結晶紫濃度為5×10-5mol/L。2.4穩(wěn)定實驗實驗表明反應5min后峰電流基本穩(wěn)定,并至少可穩(wěn)定2h以上,本實驗選取反應時間為5min。2.5標準工作曲線在選定的最佳條件下,測定BSA的線性范圍為0.5～35mg/L,回歸方程為Δip(nA)=38.7+728.84CBSA(mg/L),檢出限為0.2mg/L。對7.5mg/L的BSA溶液平行進行11次平行測定,其相對標準偏差為1.6%。同時試驗了體系對人血清白蛋白(HSA)和溶菌酶(Lyso)的響應并制定相應的標準工作曲線(表1)。由表中數(shù)據(jù)可知本方法對不同種類的蛋白質都有響應,因此可用于測定血清樣品中總蛋白的含量。2.5蘋果酸及金屬離子對測定結果的影響實驗了酪氨酸,L-胱氨酸,絲氨酸,谷氨酸,檸檬酸,蘋果酸及金屬離子如Zn2+,Fe2+,Ca2+等,結果表明低濃度的上述物質對測定結果影響不大。2.6極譜波屬性2.6.1晶紫+bsa的極譜波特性在150～600mV/s范圍內,結晶紫和結晶紫+BSA的峰電流(ip)與掃速(v)之間均呈線性關系(圖6),相關系數(shù)分別為0.9993,0.9998,說明極譜波性質為吸附波。2.6.2結晶紫在電極上的吸附行為分別測定緩沖底液(圖7,1),緩沖底液+結晶紫(圖5,2),緩沖底液+結晶紫+BSA體系(圖7,3)的電毛細管曲線,由圖可知曲線2明顯比曲線1下降,說明結晶紫在電極上有較強的吸附性,在體系中加入BSA后得曲線3,3比2明顯上升,說明結晶紫與BSA形成的復合物在電極上的吸附性比游離結晶紫的吸附性弱很多,并且對游離結晶紫的吸附作用影響很小,復合物的形成使得溶液中游離的結晶紫濃度降低,因而引起吸附電流的降低。2.7回收率測定結果取人血清樣品(由巢湖第一人民醫(yī)院提