細(xì)胞DNA定量分析的其它用途細(xì)胞DNA定量分析早期診斷肺癌常規(guī)痰學(xué)檢查診斷肺癌性很低肺癌發(fā)達(dá)國家中病死率最高沒有廣為接受的方法進(jìn)行篩查及早期診斷常規(guī)痰細(xì)胞學(xué)檢查僅能得到10%--23%的陽性結(jié)果即使是最有經(jīng)驗(yàn)的細(xì)胞學(xué)醫(yī)師，陽性率只可能達(dá)到20%--30%。常規(guī)痰學(xué)檢查和DNA定量分析的比較性研究痰標(biāo)本來自833個體，其中肺癌177例非典型增生98例無異常發(fā)現(xiàn)者558例標(biāo)本來自5個不同城市的7家醫(yī)院臨床診斷部光檢查正常肺癌非典型增生者均由病理學(xué)檢查證實(shí)雙盲法分組研究評估常規(guī)法DNA定量法和兩種方法聯(lián)合使用可檢出的痰細(xì)胞中細(xì)胞DNA定量分析能提高肺癌的檢出率常規(guī)細(xì)胞學(xué)DNA量分析敏感性特異性感性特異性腺癌 14% 90% 60% 90%早期腺癌 14% 90% 45% 90%細(xì)胞DNA定量分析早期診斷肺癌標(biāo)類痰支氣管灌洗物和刷取物細(xì)胞DNA定量分析系統(tǒng)檢測胸腹水中的癌細(xì)胞腹水細(xì)胞學(xué)檢查鑒別癌性和炎水腹水細(xì)胞學(xué)檢查在鑒別癌性腹水和炎性腹水中起著關(guān)鍵性作用63例腹水標(biāo)本被包括在研究中腹水經(jīng)離心后制片，巴氏和DNA染色每例至少有4000個腹水細(xì)胞核接受A析細(xì)胞DNA定量分析用于炎性和癌性腹水的鑒別診斷較常規(guī)細(xì)胞學(xué)方法更客觀、敏感腹水性質(zhì) 例數(shù)炎性腹水急性炎癥 4慢性炎癥 7結(jié)核性15癌性腹水惡性間皮瘤 4轉(zhuǎn)移性腫瘤 33

炎性細(xì)胞）46.±6.646.±1.68.8±1.15.±1.04.8±1.0

2倍體細(xì)胞）46.±8.074.±18.076.±3.866.±072.0±3.9

異倍體細(xì)胞）0.±0.10.±0.80.6±0.24±1.69.7±1.0對炎性和癌性腹水的正確診斷率炎性腹水 癌性腹水常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查 88% 84%DNA定量分析 100% 92%細(xì)胞DNA定量分析的其它用途使用細(xì)胞A定量分析對消化道、泌尿道、口腔及咽喉的脫落細(xì)胞進(jìn)行腫瘤也已經(jīng)獲得令人滿意的結(jié)果乳腺包塊和甲狀腺包塊的細(xì)針穿刺物也是DNA定量分析的合適標(biāo)本核酸檢測技術(shù)基本概念定義：通過檢測與疾病相關(guān)的DNA或RNA來檢測和診斷疾病簡史核測技術(shù)是分子領(lǐng)域中重要組成部分經(jīng)歷了前多聚酶鏈（PCR）期，PCR期和后PCR。程分期 時段前PCR期1976-1985PCR期1985-1995后PCR期 1995-今

主要技術(shù)平臺核酸雜交技術(shù)PCR擴(kuò)增技術(shù)DNA芯片等高通量技術(shù)最躍幾領(lǐng)：傳染病和感染性疾病各種病原的檢測、耐藥基因檢測及分子流行病學(xué)調(diào)查血液病學(xué)和腫瘤學(xué)早期診斷、確診、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的監(jiān)測，預(yù)警，預(yù)后推測、耐藥基因推測及化療效果評估等遺傳病家譜分析、診斷及遺傳趨勢分析等鑒定試驗(yàn)親緣鑒定、移植物抗宿主反應(yīng)監(jiān)測，刑事學(xué)等。多聚酶鏈反應(yīng)—PCR基本原理多聚酶鏈反應(yīng)是一項(xiàng)根據(jù)DNA補(bǔ)理耐熱DNA聚合酶催化由引物起始鏈延長制新DNA分子的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)PCR反應(yīng)髓是在短時間內(nèi)擴(kuò)增出大量的特定DNA片片斷。一個拷貝數(shù)的目的基因 1~時增十億個擴(kuò)增產(chǎn)物PCR的使用引起病原學(xué)檢測的一場革命：引起人類感染的病原僅有5%可以通過人工培養(yǎng)等常規(guī)方法進(jìn)行檢測以PCR和雜交技術(shù)為代表的分子診斷技術(shù)有望檢測其它95%的感染病原PCR是目前檢測感染病原的最敏感技術(shù)Bg樣本中的數(shù)目1001,000101 10,,0100101001,000擴(kuò)增技術(shù) 酶聯(lián)免疫或探針培養(yǎng)95% 80% 60%敏感性比敏（%（％）人類乳頭狀瘤病毒的檢測人類乳頭狀瘤病毒人類乳頭狀瘤病（Humanpapillomavirus,HPV是一組包括100余個亞型的DNA毒多亞型與皮膚粘膜的及惡性病變有關(guān)。在人類生殖道已經(jīng)分離和鑒定出40余個亞型至少有15個亞型被確定與宮頸癌密切相關(guān)，他們被稱為高危人類乳頭狀瘤病毒（HighRiskHP,簡稱HRHP）人類乳頭狀瘤病毒與宮頸癌人類乳頭狀瘤病毒是最先被確病毒之一主起殖道和肛門癌持續(xù)攜帶HRHPV誘發(fā)宮頸癌的病理學(xué)現(xiàn)象已經(jīng)被廣泛實(shí)520％女性攜帶HRHP,35歲以上的女性持續(xù)攜帶而HRHPV也與宮變的程度密切相關(guān)。因此，在英、美等發(fā)達(dá)國家，HPV的檢測已經(jīng)成為宮頸癌普查常規(guī)的一部分，HRHPV的檢出被作為宮頸癌預(yù)警、監(jiān)測、早期診斷及病情進(jìn)展的重要指標(biāo)。高危亞類乳頭狀瘤病毒頸癌細(xì)胞形態(tài)分關(guān)系形例數(shù)VH）V：形 V（0）

26 0 1（8）（3）93 9 1（1） （8）（6）99 3 1（2） （))癌74 9 1（3） ))計(jì) 41 1 1))資料來自于對1699例在宮頸癌普查中發(fā)現(xiàn)或懷疑細(xì)胞學(xué)異常的864例進(jìn)行的人類乳瘤病毒檢測和病診斷的平行研究人類乳頭狀瘤病毒對宮頸癌的“預(yù)警”作用1、大量的研究表明在兩年之內(nèi)，近30％的HRHPV攜帶者可發(fā)展為有3％的低危亞型(LRHPV)者發(fā)生相應(yīng)的變化。260～70％宮頸細(xì)胞學(xué)檢查正常的HRHPV攜帶者，在四年內(nèi)可出現(xiàn)宮頸細(xì)胞檢查異常。3、連續(xù)兩次HRHPV檢測者,在2～4年內(nèi)一般不會出現(xiàn)宮頸細(xì)胞學(xué)檢查異常。萬蓋得建立的宮頸癌預(yù)警－監(jiān)測－早期診斷系統(tǒng)建立多重PCR技術(shù)檢測全部15個HRHP用DNA定量分析進(jìn)行宮頸細(xì)胞學(xué)檢查HPV檢測可以篩選出潛在的宮頸癌行HPV檢測和DNA定量分析將極大地提高宮頸癌的早期檢出率，從而提高治愈率。該系統(tǒng)基本流程如下：篩查 預(yù)警 監(jiān)測重點(diǎn)監(jiān)測 早期診斷～２復(fù)查３～查A量析RV測

A定量異常HRPV陽性A定量正常HRHPV陽性

組織活檢DNA定量異常HRV性 組織活檢DNA量正常V陰性A定量正常RPV性宮頸標(biāo)本采集、送檢注意事項(xiàng)1.與萬蓋得門診部聯(lián)系，領(lǐng)取配套的宮頸刷、固定液及標(biāo)本管等取材必備物品。2.以宮頸外口為圓心用宮頸刷輕輕刷取35周不要過分用力以免損傷引起出血。若白帶過多，應(yīng)先用無菌干棉球輕試去，再刷取標(biāo)本圖）3.刷取完畢后用鑷子將刷頭取下放入盛有10ml固定液的標(biāo)本收集管內(nèi)，使細(xì)胞樣品存留在固定。4.填寫申請單，將條形碼分別貼在標(biāo)本管和申請單上。5.標(biāo)本管請放置于陰涼避光處過30在（4℃）保存。6.完成上訴步驟后知萬蓋得物流部標(biāo)本運(yùn)送過程。7.多重PCR檢測人類乳頭狀瘤病毒（與DNA定量分析共用同一液基標(biāo)本，也可單獨(dú)采集宮頸泌物送檢。慢性生殖道感染和性傳播疾病病原檢測慢性生殖道感染和性傳播性疾病是一組全球范圍內(nèi)非常多見的疾病美國每年有120萬性傳播疾病新發(fā)病例每年全球有超過2000萬例新發(fā)生的生殖道潰瘍性疾?。ㄒ卜Q軟性下疳）國內(nèi)在過去20年中發(fā)病率明顯上升但缺乏系統(tǒng)的發(fā)病率和流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)資料是一組可預(yù)防和可控制的疾病行為改變：可減少被感染和感染他人的機(jī)會生物醫(yī)學(xué)介入明確的診斷和恰當(dāng)?shù)闹委熆芍斡∪瞬p少傳染來源引起慢性生殖道感染和性傳播疾病的常見病原細(xì)菌和寄生蟲類：沙眼衣原體、淋病奈瑟球菌、蒼白密螺旋體、杜克嗜血桿菌、解脲支原體、生殖道支原體及陰道毛滴蟲等病毒類：1型和2型艾滋病毒（HIV-1和HIV-2，1型和2型單純胞疹病毒（HSV-1和HSV-2，人類乳頭狀瘤病毒(HPV)，乙型肝炎病毒（HBV）及巨細(xì)胞病毒(CMV)等對兩組疾病的診斷困難造成對發(fā)病率統(tǒng)計(jì)的困難較高比例的病人無明顯臨床癥狀絕大多數(shù)病人無特異性癥狀一定比例的病人為混合感染對多數(shù)病原缺乏可靠的實(shí)驗(yàn)室診斷方法可選擇的實(shí)驗(yàn)檢測方法及優(yōu)、缺點(diǎn)直接涂片鏡檢：簡便快捷但缺乏敏感性人工培養(yǎng)：中等敏感性、高度特異性，僅部分病原可人工培養(yǎng)非擴(kuò)增法血清學(xué)抗體檢查：回顧性EIA抗原抗體檢查：中等敏感度，僅為回顧性直接熒光抗體檢查：中等敏感度DNA探針檢查:中等敏感度分子擴(kuò)增法：高度敏感和特異性，正成為很多病原檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，需分子技術(shù)支持分子擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用促進(jìn)了對性傳播疾病的了解以沙眼衣原體為例，多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）為主體的分子檢測技術(shù)提供了如下信息：發(fā)病早：在年輕人群開始發(fā)病，女性為15-19歲；男性為20-24歲攜帶率高：人群中平均沙眼衣原體攜帶率為3-5%，美國育齡婦女?dāng)y帶率可高達(dá)25%性傳播疾病患者中的高檢出率因性病就診者中20%可查出沙眼衣原體無癥狀攜帶者構(gòu)成主要傳染源：80%女性和50%男性感染沙眼衣原體者無臨床癥狀PR已成為檢測性病病原的金標(biāo)準(zhǔn)沙眼衣原體不同檢測技術(shù)的比較方法 敏感性 特異性培養(yǎng)法70%-80%100%直接熒光抗體70%-80%約100%EIA70%-80%約100%探針雜交70%-80%約100%PCR100%約100%萬蓋得開發(fā)的多重PCR技術(shù)檢測性傳播疾病病原病原選擇：被測病原 臨床和實(shí)驗(yàn)室特征淋病奈瑟球全世界每年約有780萬新發(fā)病例，最優(yōu)化的培養(yǎng)菌 條件可達(dá)80~95%陽性率沙眼衣原體占非淋病性病的30~50%，培養(yǎng)陽性率低生殖道支原新確定的性病病原，無法人工培養(yǎng)體解脲支原體人工培養(yǎng)生長緩慢也引起新生兒呼吸道及中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染杜克嗜血桿新確定的性病病原，無法人工培養(yǎng)菌蒼白密螺旋傳統(tǒng)的性病病原，目前仍不少見體陰道毛滴蟲常見生殖道感染病原每年全球約有1億3千萬新發(fā)病例，培養(yǎng)要求高，生長慢萬蓋得多重PCR性病病原檢測的方法學(xué)特征：兩套引物確保檢測結(jié)果的可靠性第一套引物檢測上述七種病原第二套引物證實(shí)第一套引物擴(kuò)增的陽性結(jié)果敏感快捷全部檢測過程在24小時內(nèi)完成310-ng的目的DNA可被測出檢測標(biāo)本女性：尿道和宮頸分泌物男性：尿道分泌物和前列腺液萬蓋得多重PCR性病病原檢測的適用人群：性傳播疾病的高危人群冶游史者性工作者慢性泌尿生殖道感染人群多數(shù)性病病原也可通過密切接觸而發(fā)生慢性泌尿生殖系統(tǒng)感染性病患者的性伴侶婚前體檢篩查年輕的無癥狀攜帶者防止婚后交互感染腦脊液中病原的檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和診斷重癥中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病死常規(guī)實(shí)驗(yàn)室診斷不能為臨床常規(guī)檢測方法的低敏感性：1、愈來愈多的病毒染2、部分細(xì)菌性和多數(shù)病毒性病原不能用人工培養(yǎng)法檢測3、采集標(biāo)本前使用素降低陽性檢出率人類皰疹病毒經(jīng)常引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的常見皰疹病毒如下：1型和2型人類單純皰疹病HSV-1和HSV-2帶狀皰疹病VZV，巨細(xì)胞病毒CMV，和EB病毒EBV。由于一些有效的抗病毒已經(jīng)用于臨床，早期正確的診斷病毒性病原已經(jīng)具有實(shí)際意義。腦脊液中檢測病毒的困難傳統(tǒng)試驗(yàn)診斷技術(shù)的局限性活體腦組織中分離病毒陽性率僅為40%-60%腦脊液細(xì)胞培養(yǎng)的陽性率很低腦脊液和血清EISA病毒抗體檢測陽性只能回顧性的證實(shí)感染曾經(jīng)發(fā)生腦脊液病毒抗原檢測的敏還沒有達(dá)到令人的程度腦脊液病毒病原的分子檢測在英達(dá)國家PCR技術(shù)檢測腦脊液中的病毒已被廣泛接受PCR獲得陽性結(jié)果的機(jī)會比傳統(tǒng)法高88倍PCR法檢測腦脊液中皰疹病毒（Mayoclinic,May1999-May2001）病毒 檢測例數(shù) 陽性例數(shù)()人類單純皰疹病毒128641型2型帶狀皰疹病毒 179巨細(xì)胞病毒 158B病毒 892總計(jì) 16093

5224.0）1641.2）358(2.8）18)28(2.)64(7.)742(4.)萬蓋得多重PCR檢測腦脊液中的皰疹病毒單管多重PCR同時檢測7種皰疹病毒人類單純皰疹病毒1型和2型帶狀皰疹病毒巨細(xì)胞病毒EB病毒人類皰疹病毒6和7型的陽性對照DNA能被測出最小標(biāo)本需求量僅為200升細(xì)菌性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染細(xì)菌性腦膜炎仍為世界范圍內(nèi)的常見病可為輕癥，也可為重癥致死性感染單純感染：病死率2～3％伴中毒性休克：病死率高于50％傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)診斷的局限性顯微鏡下觀察：敏感性低細(xì)菌培養(yǎng)：耗時長，陽性率低免疫抗原檢查：低敏感性免疫抗體檢查“回顧性”PR法檢測腦脊液中病原明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法不同方法檢測CSF中腦膜炎雙球菌的比較法 數(shù) 檢果（））總）片檢 73SF養(yǎng)3血培養(yǎng) 13

1/73）971)165)

512)281)6()

23)17(3）202)CFPR 56 133) 167) 569)血PCR0110)/()600)服對PCR檢查不成顯影響用抗生素后不同時間采集標(biāo)本陽性檢出結(jié)果（％）方法 ＜12h培養(yǎng)0/0(0)鏡檢6/20(30)FR)血R )

12~48h0/8(0)3/8(38)4/5(80)4/9(44)

48~72h0/2()0/3()2/3(7)0/0()

總計(jì)0/31(0)9/31(29)23/27(85)13/18(72)萬蓋得建立的多重PCR同時檢測6種以上細(xì)菌病原被檢測的細(xì)菌性病原嗜單核細(xì)胞李斯特菌和大腸桿菌其他細(xì)菌技術(shù)特征：分兩步三組多重PCR擴(kuò)增鑒定上述病原呼吸道感染病原的檢測呼吸道感染是人類最重要的感染之一肺炎在成人和兒童都是最常見的感染之一在發(fā)展中國家，病死兒童中30％是由于呼吸道感染典型和非典型性肺炎典型肺炎：約2／3由肺炎雙球菌引起百日咳桿菌等病毒正成為呼吸道感染的優(yōu)勢病原70％兒童呼感染30％成人呼感染檢測呼吸道感染病原存在著不同的困難病原學(xué)診斷不能為流行病學(xué)和臨床治療提供足夠的支持在部份分子方法使用后，仍有50％的呼吸道感染無法檢測到病原常規(guī)監(jiān)測技術(shù)的局限性直接涂片：低敏感性（細(xì)菌）測（病毒）培養(yǎng)：生長緩慢病原）或不能生長（部分病毒）血清學(xué)檢查：低敏感性或“回顧性”PR檢測細(xì)菌性非典型肺炎病原明顯優(yōu)于常規(guī)法125份本雙究29％P