神經(jīng)發(fā)育過程中nerin基因家族的研究進(jìn)展

在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，通過各種外部環(huán)境因素，神經(jīng)及其目標(biāo)細(xì)胞之間的精確聯(lián)系形成。這些因子通過作用于軸突生長錐上的相應(yīng)受體而誘導(dǎo)或排斥軸突生長,從而決定了軸突的生長路線以及軸突與特定靶細(xì)胞的功能聯(lián)系。Netrin基因家族是此類因子的代表之一,根據(jù)位于軸突生長錐上的Netrin受體不同,Netrin在神經(jīng)發(fā)育的不同時期或不同腦區(qū)可分別發(fā)生化學(xué)吸引和排斥作用,從而在軸突的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。由于Netrin/DCC信號也能調(diào)控上皮細(xì)胞凋亡,從而提示Netrin基因家族在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中可能還涉及到對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。本文將綜述近年來Netrin基因家族的研究進(jìn)展。1.軸突生長的發(fā)現(xiàn)發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)中的一個基本概念是軸突的生長嚴(yán)格地受特異的細(xì)胞外信號調(diào)控。這一假說是由RamonyCajal根據(jù)對固定組織切片和外周神經(jīng)再生實驗中發(fā)育神經(jīng)元的觀察而首先提出的。在這些研究中,他采用“生長錐(growthcone)”一詞來描述多形的生長軸突的尖端,而且假定存在可擴(kuò)散的物質(zhì)指導(dǎo)軸突生長。這一假設(shè)直到20世紀(jì)70年代末Gundersen等證明生長錐是神經(jīng)生長因子(NGF)的一個點狀放射源時才得到部分證實。這是第一個證實由分泌或環(huán)境因子指導(dǎo)軸突生長的重要實驗。到80年代初期,Lumsden等進(jìn)一步利用置于膠原凝膠中的組織外植體證明,在體外,軸突總是特異地向其靶細(xì)胞生長。隨后在80年代中,陸續(xù)發(fā)現(xiàn)軸突的生長既涉及到誘向的問題又涉及到斥向即化學(xué)排斥的問題?；瘜W(xué)排斥是指由分泌的因子在特定的區(qū)域排斥軸突生長。其中比較經(jīng)典的實驗是Davies等證明了生長的運(yùn)動和感覺神經(jīng)元軸突能夠被一種可擴(kuò)散的分子從一部分雞胚胎中排斥。同時期Raper和他的同事則從雞腦中分離出一種被稱為腦衰蛋白(Collapsin)的分子,它可以引起組織培養(yǎng)中生長軸突和生長錐的尖端萎縮或崩解。此后在脊椎和無脊椎動物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了其同源基因,進(jìn)而這些因子被重新統(tǒng)一命名為Semaphorin(Sema)家族。耶魯大學(xué)的Rothberg等于1988年克隆了果蠅的slit基因,他們發(fā)現(xiàn)slit基因編碼的是一個比較大的分泌性蛋白質(zhì)。1995、1996年美國華盛頓大學(xué)的饒毅及其同事相繼從非洲爪蟾、雞、和鼠中克隆了slit基因,并證明Slit是一個重要的斥向因子。而在1995年,Bonhoeffer和Flanagan所在的兩個實驗室則發(fā)現(xiàn)Ephrin家族的分子對視覺系統(tǒng)內(nèi)軸突有排斥性作用。這個家族在哺乳類已知有八個成員,其作用并不限于視覺系統(tǒng)。本文的目的是重點介紹Netrin基因家族,目前認(rèn)為至少有四種軸突導(dǎo)向分子及其受體家族(Netrin,Sema,Slit和Ephrin)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起著重要的軸突誘向/斥向生長作用。2.工商類質(zhì)分子中的工商和變形Tessier-Lavigne等于1988年用膠原凝膠培養(yǎng)方法證明存在一類由底板分泌的因子,它能特異性地吸引軸突向底板方向生長。此后在一系列實驗中,Tessier-Lavigne對從體外膠原凝膠中背神經(jīng)管外植體生長出來的軸突進(jìn)行分析,分離了此類因子。他們分離出兩種分子量約80kD的蛋白質(zhì),克隆了相應(yīng)的cDNA,并將其分別命名為netrin-1和netrin-2,這兩種基因編碼的蛋白質(zhì)有78%的同源性。后來netrin蛋白被證明是秀麗線蟲(C.elegans)中UNC-6蛋白的一種脊椎動物的同源物,而已知UNC-6與軸突向?qū)Ш图?xì)胞遷移有關(guān)。在蠕蟲中UNC-6基因突變可破壞軸突向?qū)Ш椭信邔蛹?xì)胞遷移,而且對其在發(fā)育過程中的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn),UNC-6除可調(diào)控背腹神經(jīng)元軸突的導(dǎo)向和中胚層的遷移外還可由先鋒(pioneer)神經(jīng)元所表達(dá),用以指導(dǎo)隨后的軸突朝向它們的靶細(xì)胞遷移。在分離了脊椎動物netrin和確認(rèn)它們與UNC-6的同源性之后,又確認(rèn)了在一系列其它種屬中的同源物。迄今為止相繼發(fā)現(xiàn)了多種Netrin基因家族成員:首先UNC-6在線蟲(C.elegans)中被發(fā)現(xiàn)(Ishii等,1992),隨后在果蠅(Drosophila)中發(fā)現(xiàn)了Netrin-A和Netrin-B(Harris等,1996;Mitchell等,1996)。在脊椎動物發(fā)現(xiàn)了四種Netrin:Netrin-1在小雞(Serafini等,1994)、鼠(Serafini等,1996)、非洲爪蟾(Xenopus)(delaTorre等,1997)、斑馬魚(Zebrafish)(Lauderdale等,1997;Strahle等,1997)和人(Meyerhardt等,1999)被發(fā)現(xiàn);Netrin-2在小雞被發(fā)現(xiàn)(Serafini等,1994);Netrin-3在人(NTN2L;VanRaay等,1997)和鼠(Wang等,1999)被發(fā)現(xiàn);Netrin-4在人(ManuelKoch等,2000)和鼠(YinYong等,2000)被發(fā)現(xiàn)。利用DNAMAN軟件對Netrin家族進(jìn)行進(jìn)化樹分析,如圖1所示。Netrin基因家族在生物進(jìn)化過程中十分重要。目前一般認(rèn)為Netrin基因家族包括4個亞家族,其中以NetrinA、B亞家族進(jìn)化較早且比較穩(wěn)定。通過SMART服務(wù)器分析圖1中的所有蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)功能域時發(fā)現(xiàn),它們在各種屬之間有顯著的保守性,其N末端(約450個氨基酸(aminoacid,aa)與層粘連蛋白(Laminin)的N末端相似,但其C末端(約150aa)與層粘連蛋白不同。Netrin蛋白一般在550～800個aa之間。所有Netrin都包括6個可識別的結(jié)構(gòu)域(圖2)。從N端到C端依次是:(1)信號肽SP(SignalPeptide);(2)與層粘連蛋白Ⅵ結(jié)構(gòu)域相似的結(jié)構(gòu)域LamNT(LamininN-terminaldomain);(3)、(4)、(5)類似層粘連蛋白V結(jié)構(gòu)域的3個表皮生長因子(EGF)重復(fù)(LamEGFrepeat);(6)此種蛋白在種屬間最為可變的一個結(jié)構(gòu)域Netrin-CT(NetrinC-terminaldomain)。采用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),Netrin基因家族在神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達(dá),Netrin-1在發(fā)育中的脊髓底板、腦室腹側(cè)區(qū)大量表達(dá);Netrin-2在整個脊髓和背根神經(jīng)節(jié)中表達(dá),但不在底板表達(dá);Netrin-3在感覺神經(jīng)節(jié)表達(dá),同樣也不在底板表達(dá);Netrin-4在視網(wǎng)膜和嗅球大量表達(dá),而不似Netrin1-3等在脊髓或背根神經(jīng)節(jié)表達(dá)。3.工物利益對養(yǎng)分蛋白的誘導(dǎo)作用Netrin蛋白最重要的功能在于它們是許多脊椎動物和無脊椎動物軸突生長的誘向因子,能夠誘導(dǎo)發(fā)育的軸突生長較長的距離到達(dá)靶細(xì)胞。例如,離體的小腦經(jīng)組織培養(yǎng),軸突在體外可被底板外植體所吸引,這就是由底板細(xì)胞表達(dá)的Netrin蛋白所產(chǎn)生的結(jié)果。還有,在脊椎動物脊髓發(fā)育或無脊椎動物神經(jīng)索發(fā)育中軸突通常穿過中線,而在缺乏Netrin的鼠、C.elegans和果蠅中軸突卻不能穿過。這些都充分證明了Netrin蛋白對發(fā)育軸突的誘向作用。另外Netrin蛋白有時在中線表現(xiàn)出一種斥向功能,排斥某種發(fā)育軸突,這一點與Slit蛋白比較相近。例如,一種底板因子在體外能排斥滑車神經(jīng)運(yùn)動神經(jīng)元軸突遠(yuǎn)離中線,這一作用可用Netrin蛋白模擬。另外Netrin蛋白在體外也可以排斥顱運(yùn)動神經(jīng)軸突生長。對于Netrin這種雙重功能,Bashaw等通過實驗得到證明:Frazzled(Fra)是Netrin在果蠅中的吸引性受體,Roundabout(Robo)是Slit的排斥性受體,它們分別構(gòu)建了這兩個受體的嵌合體Fra-Robo(Fra的胞外區(qū)連接Robo的胞內(nèi)區(qū))和Robo-Fra(Robo的胞外區(qū)連接Fra的胞內(nèi)區(qū)),FraRobo成為Netrin蛋白的排斥性受體,表達(dá)Fra-Robo的神經(jīng)軸突避開了表達(dá)Netrin蛋白的中線;而Robo-Fra則成為Slit的吸引性受體,表達(dá)Fra-Robo的神經(jīng)軸突被吸引到表達(dá)Netrin蛋白的中線。這個實驗一方面證明了胞外區(qū)是受體識別Netrin和Slit蛋白的功能區(qū),另一方面也證明了是受體的胞內(nèi)區(qū)決定了軸突的生長趨勢,而與胞外區(qū)特異結(jié)合的蛋白因子無關(guān)。對于Netrin蛋白這個誘向因子來說沒有本質(zhì)的吸引或排斥,這都取決于它的受體。4.網(wǎng)絡(luò)能量和作用機(jī)制4.1ung-5基因編碼及其同源物Hedgecock等于1990年通過遺傳篩選在C.elegans中確認(rèn)UNC-6基因具有神經(jīng)元軸突誘向作用的同時,也確認(rèn)了兩種其它基因在此途徑中起作用,即UNC-5和UNC-40。它們的突變會影響神經(jīng)元軸突的誘向生長,說明這兩個基因可能都編碼UNC-6受體。后來克隆了三種UNC-5基因的脊椎動物同源物,它們能在體外結(jié)合Netrin-1蛋白,并進(jìn)一步證明了UNC-5及其同源物編碼Netrin受體組分。Vogelstein等則發(fā)現(xiàn)了另一種Netrin受體即DCC(Deletedcolorectalcancer)基因,它位于人染色體18q,通常在人類轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌中缺乏。隨后在鼠、雞和非洲爪蟾中都發(fā)現(xiàn)了DCC的同源物,并且在所有這些種屬體內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)。體外實驗證明,抗DCC的抗體可以抑制Netrin對神經(jīng)元軸突生長的誘向作用,說明DCC可能是一種Netrin受體。后來在雞神經(jīng)系統(tǒng)中還發(fā)現(xiàn)了Neogenin蛋白也能在體外結(jié)合Netrin-1。Frazzled34則是DCC在果蠅中的同源物。4.2分子活性化合物fn3和c.eleg現(xiàn)行的蛋白表達(dá)所有這些Netrin受體都是膜結(jié)合的受體,由3個功能區(qū)組成,即胞外區(qū)、跨膜區(qū)TM(Transmembrane)和胞內(nèi)區(qū)。如DCC蛋白(圖3)的胞外區(qū)是由4個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域IG(Immunoglobulin)和6個Ⅲ型纖維連接蛋白結(jié)構(gòu)域FN3(Fibronectintype3)組成的,是結(jié)合Netrin的區(qū)域;跨膜區(qū)含有豐富的疏水性氨基酸;胞內(nèi)區(qū)一般是信號傳導(dǎo)區(qū)。Frazzled、UNC-40和Neogenin蛋白都有著與DCC相似的功能區(qū)結(jié)構(gòu),同時與DCC一樣都介導(dǎo)軸突朝向UNC-6/Netrin蛋白方向生長,可稱之為吸引性受體。而C.elegans的UNC-5蛋白(圖4)則不同,其胞外區(qū)包含兩個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(IG)和兩個血小板反應(yīng)蛋白I型結(jié)構(gòu)域TSP1(Thrombospondintype1),胞內(nèi)區(qū)由一個功能未知的結(jié)構(gòu)域ZU5(ZO-1andUnc5-likenetrinreceptors)和一個與細(xì)胞凋亡有關(guān)的DEATH結(jié)構(gòu)域組成。它介導(dǎo)軸突遠(yuǎn)離UNC-6/Netrin蛋白方向生長,可稱之為排斥性受體。4.3工細(xì)胞其他結(jié)構(gòu)的作用在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制方面Song等通過實驗證明,在生長錐中環(huán)核苷酸的水平可以影響到生長錐對一種軸突誘向分子的反應(yīng)特性。在一系列實驗中,他們發(fā)現(xiàn)在生長錐中增加cAMP或cGMP的水平時可將排斥信號改變?yōu)槲盘?而降低環(huán)核苷酸水平則可將吸引信號變?yōu)榕懦庑盘?。另外在這種作用中某種環(huán)核苷酸對于軸突誘向因子是特異的,例如:通常被Netrin-1所吸引的神經(jīng)元軸突在細(xì)胞內(nèi)cAMP水平減少時則可被Netrin-1排斥;相反的,一般被導(dǎo)向蛋白3(Sema3)排斥的一些神經(jīng)元軸突,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)cGMP水平增加時則可導(dǎo)致這些神經(jīng)元軸突被Sema3所吸引。由于環(huán)核苷酸是許多細(xì)胞表面受體的第二信使,那么由環(huán)核苷酸水平調(diào)控的反應(yīng)就可能存在一種機(jī)制,通過這種機(jī)制生長錐可與細(xì)胞外信號整合,在不同環(huán)境下以不同方式對同樣信號作出反應(yīng)。Netrin除了誘導(dǎo)脊椎動物和無脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的軸突生長外還與神經(jīng)系統(tǒng)其它部分的軸突向?qū)в嘘P(guān)。目前最好的研究例是果蠅Netrin在外周神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用。果蠅的NetrinA、NetrinB除了由中線神經(jīng)膠質(zhì)表達(dá)外多在周邊不連續(xù)的肌肉群中表達(dá),任一種Netrin在肌肉群中錯誤表達(dá)都會導(dǎo)致運(yùn)動神經(jīng)元軸突被誤導(dǎo)向不與其相對應(yīng)的肌肉,說明Netrin與外周運(yùn)動神經(jīng)神經(jīng)元軸突向?qū)в嘘P(guān)。但是在脊椎動物中是否有同樣的機(jī)制起作用仍不清楚,目前也還沒有脊椎動物中Netrin突變導(dǎo)致運(yùn)動神經(jīng)元軸突錯誤向?qū)У膱蟮?。最近還發(fā)現(xiàn)了Netrin的一種可能的新功能,即Netrin/DCC信號在上皮細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用。在一系列的證據(jù)充分的實驗中,發(fā)現(xiàn)受體DCC在人胚胎腎細(xì)胞系(293T細(xì)胞)中表達(dá)時,能夠激活一種細(xì)胞凋亡途徑。這種途徑在當(dāng)受體DCC被Netrin占據(jù)時被抑制。這一工作對于DCC作為一種腫瘤抑制基因的功能以及它在發(fā)育和成人神經(jīng)系統(tǒng)中的功能都很重要。DCC的腫瘤或者轉(zhuǎn)移-抑制功能的可能機(jī)制是它作為依賴性受體起作用,即表達(dá)DCC的細(xì)胞的存活依賴于其配體的持續(xù)存在,如轉(zhuǎn)移到無Netrin的區(qū)域細(xì)胞即將死亡,而DCC基因缺失的細(xì)胞可存活。此點可能與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中特定細(xì)胞的凋亡有關(guān)。5關(guān)于環(huán)核苷酸并未發(fā)現(xiàn)其作用的機(jī)制根據(jù)以上所述可以了解,具有軸突誘向生長和斥向生長功能的Netrin家族基因的發(fā)現(xiàn)極大地促進(jìn)了發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)的發(fā)展。在誘向軸突生長方面,Netrin的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制目前仍不清楚。雖然其受體已經(jīng)被克隆,但最重要的是,還不清楚生長錐如何感應(yīng)