結(jié)球甘藍(lán)boexu基因克隆及序列分析

花粉發(fā)芽和花粉管生長有許多復(fù)雜的過程?；ǚ酃苤械奈⒔z束與花粉管長軸平行排列,微絲骨架組織的變化、肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白活性的調(diào)節(jié)都會(huì)影響花粉萌發(fā)及花粉管頂端生長(孫穎等,2001)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)延伸因子中的eEF1α(eukaryoticelongationfactor1alpha)可通過結(jié)合微管(Durao&Cyr,1994;Dursoetal.,1996)和切割微管(Shiinaetal.,1994)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu),細(xì)胞骨架的重排影響上游信號(hào)因子的活性,從而參與信號(hào)的傳導(dǎo)。延伸因子(elongationfactor)是參與蛋白翻譯延伸的重要蛋白質(zhì),它們通過在核糖體上催化氨基酸鏈的延伸而推動(dòng)、控制蛋白質(zhì)的合成。原核生物的延伸因子為EF-T(包括EF-Tu和EF-Ts)和EF-G;真核生物的延伸因子為eEF-l[包括eEF1A(α)、eEF1Bα、eEF1Bβ和eEF1Bγ4個(gè)亞基]和eEF-2(覃迎姿等,2009)。研究發(fā)現(xiàn)真核生物細(xì)胞器延伸因子與細(xì)菌延伸因子EF-Tu的同源性高于胞質(zhì)延伸因子eEF1A(Gray,1992),因此在真核生物細(xì)胞器中與eEF1A相對(duì)應(yīng)的仍被稱為EF-Tu。自20世紀(jì)60年代從大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞中首先分離獲得延伸因子以來,在過去50多年對(duì)延伸因子的研究中,發(fā)現(xiàn)EF-Tu是細(xì)胞內(nèi)與翻譯機(jī)制有關(guān)的蛋白質(zhì)中含量最高的蛋白,在原核生物以及植物線粒體和質(zhì)體等細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成延伸階段發(fā)揮著重要的作用,除此之外在生長信號(hào)傳導(dǎo)、抗熱、抗旱、抗病等方面也表現(xiàn)出非常重要的作用(Fuetal.,2012)。自交不親和(self-incompatibility,SI)過程中花粉萌發(fā)和花粉管生長發(fā)育過程涉及到多種信號(hào)分子(孫梓健等,2012a)。虞美人SI反應(yīng)信號(hào)可誘導(dǎo)花粉管肌動(dòng)蛋白骨架重排,V型肌動(dòng)蛋白網(wǎng)結(jié)構(gòu)喪失,花粉管后段的肌動(dòng)蛋白束逐漸解散形成斑點(diǎn),花粉管停止生長,與單純花粉管生長抑制時(shí)微絲骨架的變化方式不同(Geitmannetal.,2000),可見影響微絲骨架重排可能與SI信號(hào)引起的胞質(zhì)游離鈣濃度的特異性變化有關(guān)。對(duì)eEF1α的研究發(fā)現(xiàn)除了參與翻譯控制有關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)外,在體內(nèi)和體外eEF1α均能同肌動(dòng)蛋白纖維及微管蛋白結(jié)合,抑制肌動(dòng)蛋白的聚合速度,穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白纖維,參與細(xì)胞生長、應(yīng)激反應(yīng)及運(yùn)動(dòng)性有關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)。目前關(guān)于延伸因子是否參與自交不親和花粉萌發(fā)及花粉管生長的信號(hào)調(diào)節(jié),還不清楚。因此探索翻譯延伸因子在其花粉萌發(fā)和花粉管生長信號(hào)傳導(dǎo)中的作用具有重要意義。在研究結(jié)球甘藍(lán)花粉萌發(fā)前后蛋白表達(dá)譜中發(fā)現(xiàn)了很多差異蛋白,并對(duì)相關(guān)蛋白進(jìn)行了研究,如鈣調(diào)素相關(guān)蛋白(孫梓健等,2012a)、膜聯(lián)蛋白(孫梓健等,2012b)等。本試驗(yàn)中在以往研究基礎(chǔ)之上,發(fā)現(xiàn)翻譯延伸因子BoEF-Tu蛋白表達(dá)上調(diào),通過同源擴(kuò)增克隆得到BoEF-Tu基因及其全長序列,并對(duì)其序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,為進(jìn)一步研究翻譯延伸因子EF-Tu的功能及其調(diào)控方式奠定分子基礎(chǔ),也為豐富自交不親和信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)研究提供可行的參考。1材料和方法1.1b提供試驗(yàn)于2011年4月至2012年5月在西南大學(xué)重慶市蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。以結(jié)球甘藍(lán)高度自交不親和系E1的成熟花粉為材料(由西南大學(xué)十字花科蔬菜研究所提供)。蛋白抽提試劑盒和IPG膠條購自Bio-Rad,膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)MEGA公司,DNA連接酶購自東洋紡,限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物工程有限公司,DNAMarker、pEASY-Bluntsimplevector載體試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及TaqDNA聚合酶均購自Transgen公司,Trizol購自Invitrogen,引物合成及測序由北京六合華大基因公司完成,其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2花粉總蛋白的純化在相對(duì)濕度100%條件下,將收集的自交不親和系花粉靜置培養(yǎng)2h后置于花粉液體萌發(fā)培養(yǎng)基中(Robertsetal.,1983),25℃培養(yǎng)1h。將成熟未萌發(fā)以及萌發(fā)1h后的花粉分別進(jìn)行離心收集,采用ProteinExtractionKit(Bio-Rad,163-2086)抽提總蛋白,2-DCleanupKit(Bio-Rad,163-2130)純化總蛋白,除去酚類等雜質(zhì),最后使用Bradford法定量(Fermentas,#R1271),置于–80℃保存。經(jīng)過純化的花粉總蛋白第一向等電聚焦使用Bio-rad17cmIPG4~7非線性膠條,在PROTEANII(Bio-Rad)上進(jìn)行,蛋白上樣量為60μg·gel-1,等電聚焦條件為:250V1h;3000V2h;8000V2h;10000V恒壓至100000Vh。第二向SDS電泳條件:10mA·gel-1,25min;15mA·gel-1至電泳結(jié)束,銀染法染色。1.3race試驗(yàn)pcr擴(kuò)增使用Trizol法提取未萌發(fā)和萌發(fā)花粉混合樣品總RNA用于基因克隆和實(shí)時(shí)熒光定量分析,DNaseI去除總RNA樣品中的gDNA,用PrimeScriptRT-PCRKit合成第一鏈cDNA。根據(jù)雙向電泳質(zhì)譜鑒定結(jié)果以及參照擬南芥EF-Tu的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物對(duì)BoEF-Tu-F(5′-AAACTGCAAAGCGTCACTA-3′)和BoEF-Tu-R(5′-TGTCACCAGGCATAACCAT-3′)用于cDNA序列片段的擴(kuò)增。RT-PCR擴(kuò)增體系為ddH2O32uf06dL,10×PCR緩沖液5uf06dL,2mmol·L-1dNTPs5uf06dL,25mmol·L-1MgSO43uf06dL,BoCML-F/BoCML-R各1.5uf06dL,KODDNA聚合酶1uf06dL,模板DNA1uf06dL。PCR擴(kuò)增參數(shù)為94℃2min,98℃10s,46℃30s,68℃1min;35個(gè)循環(huán)。回收目的片段分別連接到pEASY-Bluntsimple克隆載體,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109,取陽性克隆進(jìn)行酶切鑒定并送測序。使用SMARTerTMRACEcDNAAmplificationKitUserManual試劑盒,根據(jù)測序得到的序列信息設(shè)計(jì)RACE引物BoEF-Tu-F-3(5′-CAGGCTGGTGACAATGTTGGACTTC-3′)/BoEF-Tu-R-5(5′-GGAACACCAACCTGACGGGCAAGT-3′)。RACE試驗(yàn)PCR擴(kuò)增體系為ddH2O12.75uf06dL,10×LATaqPCR緩沖液2.5uf06dL,2.5mmol·L-1dNTP4uf06dL,UPM引物(5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)2.5uf06dL,BoEF-Tu-F-3/BoEF-Tu-R-5(10mmol·L-1)各1uf06dL,LATaqDNA聚合酶0.25uf06dL,模板DNA1uf06dL。PCR擴(kuò)增參數(shù)為94℃3min;94℃30s,72℃3min,5個(gè)循環(huán);94℃30s,70℃30s,72℃3min,5個(gè)循環(huán);94℃30s,68℃30s,72℃3min,21個(gè)循環(huán)。1.4功能結(jié)構(gòu)的分析根據(jù)克隆得到的BoEF-Tu的cDNA讀框序列,使用VectorNTI軟件進(jìn)行預(yù)測得到氨基酸殘基序列,然后根據(jù)其他植物EF-Tu蛋白的分析(Fuetal.,2012)對(duì)BoEF-Tu的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行注釋。將預(yù)測得到的BoEF-Tu序列與從GenBank數(shù)據(jù)庫檢索到的擬南芥等部分蛋白延長因子家族氨基酸序列經(jīng)ClustalX2比對(duì)后通過MEGA軟件構(gòu)件系統(tǒng)發(fā)生樹。1.5boef-tu基因表達(dá)分析分別收集成熟萌發(fā)和未萌發(fā)的花粉樣本。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR試驗(yàn)方法采用LivakMethod(2-ΔΔCt)在C1000ThermalCycler(Bio-Rad)上進(jìn)行。試驗(yàn)以β-Actin為內(nèi)參基因(BoActin-F:TATCAACTACCAGCCACC/BoActin-R:GAACACCTCAGCTACACTC),BoEF-Tu基因表達(dá)分析引物為BoEF-Tu-F-q(ACTTCAGGGCACAAACGAT)/BoEF-Tu-R-q(TCAAGCACACGAACAGGGTC),參照SsoFastTMEvaGreenSupermix(Bio-Rad)試劑盒配制反應(yīng)體系,擴(kuò)增條件為:95℃30s;95℃10s,53.9℃30s,72℃15s,40個(gè)循環(huán)。每個(gè)取樣點(diǎn)設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù),3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。2結(jié)果與分析2.1花粉的出現(xiàn)與萌發(fā)對(duì)分別提取的甘藍(lán)成熟花粉與萌發(fā)花粉總蛋白進(jìn)行雙向電泳,結(jié)果經(jīng)PDquest軟件分析蛋白差異點(diǎn)。在成熟花粉中未出現(xiàn)的蛋白點(diǎn)(圖1,A,箭頭),在萌發(fā)后的花粉中出現(xiàn)(圖1,B,箭頭)。對(duì)該上調(diào)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析,結(jié)果顯示該蛋白點(diǎn)(ProteinID:gi|332656852|)分子量49.6kD,等電點(diǎn)6.68,序列覆蓋率(SequenceCoverage)22.03%,蛋白質(zhì)得分(Prot.Score/ionscore)226?65,與擬南芥ElongationfactorTu蛋白具有較高的同源性,命名為BoEF-Tu。2.2f-tu-f和boef-r在藍(lán)莓花粉中的擴(kuò)增根據(jù)蛋白雙向電泳質(zhì)譜鑒定結(jié)果,以結(jié)球甘藍(lán)花粉總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,使用引物BoEF-Tu-F和BoEF-Tu-R在甘藍(lán)花粉中擴(kuò)增得到867bp的片段(圖2,A)。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)5′RACE和3′RACE引物,擴(kuò)增得到662bp(圖2,B,包含UPM引物片段)的5uf0a2端片段和633bp(圖2,C,包含UPM引物片段)的3′端片段。2.3boef-tu蛋白序列及同源建模通過同源克隆及RACE等拼接擴(kuò)增產(chǎn)物,得到結(jié)球甘藍(lán)BoEF-Tu的基因序列,全長1728bp,GenBank登錄號(hào)JQ639089.1,GC含量44.85%,含有完整開放閱讀框(ORF),位于112~1473bp,3uf0a2非翻譯區(qū)255bp,5uf0a2非翻譯區(qū)111bp,加尾信號(hào)(AATAAA)位于第301bp處(圖3)。根據(jù)其cDNA序列推導(dǎo)得到BoEF-Tu蛋白由453個(gè)氨基酸殘基組成,其中酸性氨基酸80個(gè),堿性氨基酸63個(gè),分子量為49.17kD,等電點(diǎn)為6.52。對(duì)BoEF-Tu蛋白進(jìn)行在線模型分析(/),氨基酸同源建模(圖4,圖5),結(jié)果表明,此蛋白含有9個(gè)α–螺旋結(jié)構(gòu),分別位于21~22、53~61、80~93、103~105、142~151、170~180、199~215、229~234、240~254位氨基酸殘基處;含有18個(gè)β–折疊結(jié)構(gòu),分別位于氨基酸序列的117~119、122~126、157~162、185~191、225~227、275~278、283~295、299~304、312~320、334~338、350~353、363~371、389~394、397~402、409~411、416~422、433~437、441~451位氨基酸殘基處。2.4阿斯塔納的阿斯塔納分布cvi-pcr蛋白序列篩選從GenBank數(shù)據(jù)庫檢索已登錄的BoEF-Tu蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì),發(fā)現(xiàn)BoEF-Tu與擬南芥EF-TuM(CAA61511.1)、水稻EF-Tu(AAM74563.1)、蓖麻EF-Tu(XP_002524809.1)、玉米EF-TuM(AAG32661.1)、秋藻EF-TuM(XP_001418116.1)的同源性分別為93%、88%、86%、78%和76%。為進(jìn)一步研究EF-Tu蛋白的進(jìn)化關(guān)系,從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索EF-Tu的氨基酸序列,經(jīng)ClustalX2比對(duì),通過MEGA4構(gòu)件系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖6)。從圖6中可以看出,結(jié)球甘藍(lán)BoEF-Tu蛋白與擬南芥(X89227.1、NP_192202.1)最先聚為一類,親緣關(guān)系最近。2.5boef-tu在花粉萌發(fā)前后納米平臺(tái)上的表達(dá)水平采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析表達(dá)量(圖7)。結(jié)果表明,BoEF-Tu基因在花粉萌發(fā)后45min時(shí)的表達(dá)量為花粉萌發(fā)前的2.6倍,表明BoEF-Tu在花粉萌發(fā)中后期表達(dá)上調(diào),這與雙向電泳結(jié)果相同。3boef-tu的變化EF-Tu作為在細(xì)菌和植物器官細(xì)胞如質(zhì)體和線粒體中蛋白質(zhì)合成延長階段發(fā)揮重要作用的一種蛋白,具有高度的保守型,其表達(dá)受發(fā)育時(shí)期、激素和環(huán)境脅迫(包括高溫、低溫、光照、高鹽、干旱及污染物)等因素的誘導(dǎo)(Risticetal.,1991,1999;Singhetal.,2004;Momcilovic&Ristic,2007)。線粒體、質(zhì)體和胞質(zhì)翻譯延伸因子EF-Tu都有各自確定的表達(dá)模式,其中線粒體EF-Tu基因的表達(dá)在花發(fā)育過程中卻不盡統(tǒng)一。Lee等(2002)發(fā)現(xiàn)水稻線粒體EF-Tu的表達(dá)高峰出現(xiàn)在花發(fā)育的早期階段,在花的成熟階段表達(dá)量降低。本研究對(duì)甘藍(lán)萌發(fā)的花粉提取總蛋白,通過雙向電泳差異點(diǎn)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)萌發(fā)花粉中EF-Tu蛋白的表達(dá)明顯上調(diào),表明在花粉萌發(fā)和花粉管生長過程EF-Tu蛋白被大量誘導(dǎo)積累,通過RT-PCR和RACE方法從甘藍(lán)萌發(fā)花粉中擴(kuò)增得到了翻譯延伸因子EF-Tu的完整cDNA序列,全長1728bp,編碼453個(gè)氨基酸,具有翻譯延伸因子所特有的3個(gè)結(jié)構(gòu)域(GTP結(jié)合區(qū)域的結(jié)構(gòu)域I以及結(jié)合tRNA的結(jié)構(gòu)域Ⅱ和Ⅲ),不含信號(hào)肽和跨膜區(qū),并且在線粒體中存在的可能性較高,這也與水稻線粒體tufM基因全長1726bp,編碼453個(gè)氨基酸的研究結(jié)果相似(Leeetal.,2002),因此推測BoEF-Tu屬于線粒體EF-Tu基因家族。Fu等(2012)研究發(fā)現(xiàn)E.coli細(xì)胞中的EF-Tu與水稻和擬南芥的質(zhì)體EF-Tu分別具有67%和80%的相似性。本研究中氨基酸序列同源性比對(duì)也發(fā)現(xiàn)BoEF-Tu與擬南芥EF-Tu