克隆文庫的構(gòu)建及其在微生物分子生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用1.克隆文庫的構(gòu)建2.克隆文庫的篩選和鑒定3.克隆文庫在微生物分子生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用4.參考文獻(xiàn)1.克隆文庫的構(gòu)建1.1基因組文庫1.2cDNA文庫1.316SrDNA、18SrDNA文庫1.1基因組文庫1.1.1what?基因組文庫：完整的基因組文庫是含有某種生物體全部基因的隨機(jī)片段的重組DNA克隆群體。1.1.2how？構(gòu)建文庫時(shí)先將基因組DNA通過機(jī)械剪切或酶切，使之成為一定大小的片段，隨機(jī)與適當(dāng)?shù)妮d體重組、克隆。1.1.3why？A：分離有用的目的基因B：保存某種生物的全部基因理論文庫克隆子數(shù)=

基因組DNA總長ＤＮＡ片段平均長度N—基因組文庫克隆總數(shù)P—所需機(jī)率f—插入片段與基因組DNA長度之比1.1.4基因組文庫規(guī)模

實(shí)際克隆數(shù)：理論克隆數(shù)1.1.5基因組文庫的構(gòu)建步驟A：DNA片段的制備B:DNA片段與載體連接C:載體的選擇D:重組DNA的轉(zhuǎn)化和克隆E:篩選鑒定基因組A：DNA片段的制備從生物組織中分離出純化的基因組DNA，用限制酶進(jìn)行部分降解或完全降解，得到各種長度的DNA片段。B:DNA片段與載體連接用限制性內(nèi)切酶切割載體DNA，使載體形成與外源DNA相匹配的黏性末端。再用DNA連接酶將DNA片段與載體連接起來，成為重組DNA。C:載體的選擇質(zhì)粒載體可承載15kbDNA左右片段(有效的范圍為<10kb)載體可承載25kbDNA左右片段(有效的范圍為<20kb)Cosmid載體可承載45kbDNA左右片段(有效的范圍為<40kb)YAC載體系統(tǒng)：制備的基因組片段>10MbpOnemorething…D:重組DNA的轉(zhuǎn)化和克隆將重組DNA導(dǎo)入受體菌中，進(jìn)行體外包裝噬菌體進(jìn)行侵染，或者轉(zhuǎn)化時(shí)質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞。E:篩選鑒定基因組由于基因組文庫包含了DNA分子的所有隨機(jī)片段形成的重組DNA克隆，因此利用適當(dāng)?shù)蔫b定和篩選方法，就可以從中找到攜帶所需要的目的基因片段的重組克隆體。1.2cDNA文庫1.2.1what?cDNA文庫就是以生物細(xì)胞的mRNA為模板經(jīng)反轉(zhuǎn)錄變成雙鏈DNA(cDNA)，然后將這些cDNA裝入載體，而構(gòu)建成的一個(gè)含有各種cDNA克隆的克隆群。1.2.2why？由于基因組DNA中編碼基因只占了一部分（尤其是真核生物），因此可以通過mRNA反轉(zhuǎn)錄的方式得到編碼基因。cDNA文庫是獲得具有編碼序列蛋白質(zhì)基因的常用手段。1.2.3how？A：高質(zhì)量mRNA的制備B:反轉(zhuǎn)錄生成cDNAC:cDNA與載體連接D:重組DNA的轉(zhuǎn)化和克隆E:篩選鑒定cDNAA：高質(zhì)量mRNA的制備真核生物mRNA僅占總RNA含量的1%-5%。利用親和層析法分離出mRNA，再對(duì)mRNA按大小分級(jí)，使mRNA具有適當(dāng)?shù)拈L度。接下來對(duì)mRNA的翻譯活性進(jìn)行檢驗(yàn)。B:反轉(zhuǎn)錄生成cDNA以有翻譯活性的mRNA為模板在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，形成RNA-DNA雜交分子。用核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA降解，使之變成單鏈DNA。以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA。C:cDNA與載體連接將cDNA的兩端加上人工化學(xué)方法合成的人工接頭，它是其序列中含有限制酶識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸片段。用連接酶把接頭和雙鏈cDNA相互連接，再用限制酶切割，使原來的平末端的cDNA變成黏性末端，插入到已用限制酶處理的載體中，并用DNA連接酶連接起來。D:重組DNA的轉(zhuǎn)化和克隆將cDNA與載體連接成的重組DNA導(dǎo)入到受體菌菌群中儲(chǔ)存，每個(gè)受體菌都含有一段不同的cDNA。如果用到的載體為噬菌體時(shí)，含有cDNA的重組噬菌體還需要經(jīng)過體外蛋白質(zhì)外殼包裝反應(yīng)，才能成為具有侵染和復(fù)制能力的成熟噬菌體。E:篩選鑒定cDNA當(dāng)獲得了含重組DNA的宿主細(xì)胞時(shí)，即完成了基因的克隆。利用適當(dāng)?shù)蔫b定和篩選方法，就可以從中找到攜帶所需要的目的基因片段的重組克隆體。1.316SrDNA、18SrDNA文庫2.克隆文庫的篩選和鑒定2.1抗生素抗性，挑選出含有質(zhì)粒的克隆。2.2藍(lán)白斑篩選，挑出帶有插入片段的克隆。2.3核酸雜交2.4特異性免疫學(xué)檢測設(shè)計(jì)適用于藍(lán)白斑篩選的基因工程菌為β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。這種宿主菌的染色體基因組中編碼β-半乳糖苷酶的基因突變，造成其編碼的β-半乳糖苷酶失去正常N段一個(gè)146個(gè)氨基酸的短肽（即α肽鏈），從而不具有生物活性，即無法作用于X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。用于藍(lán)白斑篩選的載體具有一段稱為lacZ'的基因，lacZ'中包括：一段β-半乳糖苷酶的啟動(dòng)子；編碼α肽鏈的區(qū)段；一個(gè)多克隆位點(diǎn)(MCS)。MCS位于編碼α肽鏈的區(qū)段中，是外源DNA的選擇性插入位點(diǎn)。雖然上述缺陷株基因組無法單獨(dú)編碼有活性的β-半乳糖苷酶，但當(dāng)菌體藍(lán)白斑篩選中含有帶lacz'的質(zhì)粒后，質(zhì)粒lacz'基因編碼的α肽鏈和菌株基因組表達(dá)的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突變體互補(bǔ)，具有與完整β-半乳糖苷酶相同的作用，在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下可以使X-gal生成藍(lán)色物質(zhì)的能力，這種現(xiàn)象即α-互補(bǔ)。當(dāng)外源DNA（即目的片段）與含lacz'的載體連接時(shí)，會(huì)插入進(jìn)MCS（即靶基因），使α肽鏈讀碼框破壞，這種重組質(zhì)粒不再表達(dá)α肽鏈，將它導(dǎo)入宿主缺陷菌株則無α互補(bǔ)作用，不產(chǎn)生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培養(yǎng)基中的X-gal產(chǎn)生藍(lán)色，培養(yǎng)表型即呈現(xiàn)白色菌落。最常用、最可靠的方法之一?？纱笠?guī)模地分析文庫的克隆子。核酸雜交的主要步驟是核酸分子的變性和選擇性退火。雙鏈DNA或處于二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA分子被變性回復(fù)到它們原來單鏈、線性的形式，從而使它們處于能與互補(bǔ)的核苷酸鏈退火雜交的狀態(tài)。雙鏈DNA采用堿(如NaOH)或高溫處理變性，RNA分子則通常是在甲酰胺存在的情況下通過加熱使之變性?；パa(bǔ)的核苷酸鏈通常是外部加入的與母板RNA序列互補(bǔ)的DNA鏈與母板DNA互補(bǔ)的DNA或RNA鏈。外部加入的互補(bǔ)鏈若事先被標(biāo)記，則可以作為探針從核酸混合物中檢測到與之雜交的特定的目標(biāo)核酸序列。而且由于氫鍵的微弱性，互補(bǔ)的單鏈核