補腎方藥對衰老大鼠海馬學習記憶相關基因bdnf、rkbmrna表達的影響

隨著年齡的增長，身體各腸器官的功能逐漸減弱，老年人對外部環(huán)境變化的適應性得到顯著降低，記憶功能逐漸減弱。許多慢性疾病，如癱瘓和中風，的發(fā)病率逐漸升高。因此尋找抗衰老藥物,減少老年病的發(fā)生率,提高生存質量,無疑具有重要的意義。近年來,神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)被認為是記憶形成過程中的關鍵蛋白之一,BDNF和其受體TrkB結合發(fā)揮生物學效應。本實驗采用自然衰老大鼠模型,采用原位雜交技術,觀察經(jīng)典補腎方藥左歸丸、右歸丸對老年大鼠海馬學習記憶相關基因BDNF及其受體TrkBmRNA表達的影響,以探討老年大鼠學習記憶功能減退的分子機制,以及補腎方藥的改善作用。u3000大鼠口服蔗糖、體外生物指標檢測左歸丸和右歸丸取自《景岳全書》原方。左歸丸:由熟地黃、山藥、枸杞子、山茱萸、菟絲子、鹿角膠和龜膠組成;右歸丸:由熟地黃、制附子、肉桂、山藥、山茱萸、菟絲子、枸杞子、鹿角膠、杜仲、當歸等組成。上述藥材均購自上海華宇藥業(yè)有限公司,將各方藥按傳統(tǒng)方法水煎成劑,4℃保存?zhèn)溆?。SD雄性大鼠,清潔級,由上海中醫(yī)藥大學動物中心提供[動物合格證號:SCXK(滬)2003-0002]。采取室溫(22±1)℃,光照與黑暗時間為每12h更替。采用組間比較法分設4組:①青年對照組,5月齡;②老年對照組,24月齡;③老年左歸丸組,24月齡;④老年右歸丸組,24月齡。老年左歸丸組、老年右歸丸組從20月齡起以飲料方式分別喂左歸丸、右歸丸藥液,連續(xù)4個月,各鼠用藥劑量為0.75g生藥/100g體質量,約為臨床成人每千克體質量劑量的15倍。青年對照組、老年對照組給予正常飲水和飼料,給藥組沒有正常飲水。將各組大鼠以2%戊巴比妥鈉(40mg/kg體質量)腹腔注射麻醉,開胸,在左心室插入灌注針頭,同時剪開右心耳,先用300ml生理鹽水沖洗,再以400ml多聚甲醛固定液固定,維持30min。剝取大腦,浸入固定液2h,再浸入含30%蔗糖的磷酸緩沖液,4℃保存。待大腦下沉后,在預冷的冰凍切片機(英國SHANDON公司,型號:AS620)上切片,每片厚30μm,收集于原位雜交保護液(蔗糖300g,乙二醇300ml,0.1MPBS500ml,加DEPC水至1000ml)中,儲存于-20℃。BDNF原位雜交檢測試劑盒(編號:MK1613)、TrkB原位雜交檢測試劑盒(編號:MK1650)均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。試劑盒采用針對BDNF、TrkB的寡核苷酸探針,經(jīng)地高辛標記。按照試劑盒說明書加以改進。將切片洗滌后,用0.5%H202去除過氧化物酶,蛋白酶消化以暴露mRNA,0.1MPBS洗滌后,貼片于APES預處理的玻片上,加預雜交液40℃哺育約3h,加雜交液41℃左右過夜,SSC洗滌,滴加鼠抗地高辛,SABC,生物素化過氧化物酶,DAB顯色,最后將切片用二甲苯透明,中性樹脂封片。顯微鏡下拍攝(日本OLYMPUS公司,型號:CKX41),采用IPP(imageproplus)軟件進行圖像分析,檢測各組大鼠海馬各分區(qū)平均光密度水平,來表示mRNA的表達變化情況。海馬各區(qū)(CA1、CA2、CA3、DG)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-wayAN()VA),用Dunnett’spost-hoctest來進行比較。海馬各分區(qū)的brnfmrna表達與青年大鼠相比,老年對照組大鼠毛發(fā)稀落,沒有光澤。而兩用藥組大鼠毛發(fā)明顯較有光澤。海馬各分區(qū)(DG、CA1、CA2、CA3)分布見圖1、圖2。BDNF與TrkBmRNA表達陽性細胞胞漿呈藍紫色,而強陽性細胞甚至胞核亦呈藍紫色。青年對照組陽性細胞密集,染色較深,而老年對照組陽性細胞則相對稀疏,染色較淺。由圖1、圖2及表1、表2可見,與青年對照組相比,老年對照組海馬各分區(qū)的BDNFmRNA與TrkBmRNA表達明顯降低(P<0.05);與老年對照組比較,左歸丸與右歸丸均能明顯提高老年大鼠海馬CA1、DG區(qū)BDNFmRNA和CA2區(qū)、DG區(qū)的TrkBmRNA表達(P<0.05);對于CA3區(qū)BDNFmRNA表達,僅老年右歸丸組高于老年對照組(P<0.05),但對CA2區(qū),老年對照組、老年左歸丸組與老年右歸丸組之間無明顯差別;而CA1區(qū)和CA3區(qū)TrkBmRNA的表達,僅老年左歸丸組高于老年對照組(P<0.05)。綜合比較分析,老年左歸丸組指標要略優(yōu)于老年右歸丸組。有利于維持神經(jīng)元功能自上世紀70年代以來,研究表明長時程突觸傳遞增強(LTP)反應與學習記憶過程關系密切,被認為是研究學習和記憶機制的主要模式。LTP的形成是神經(jīng)元突觸前與突觸后機制共同作用的結果,而海馬是神經(jīng)系統(tǒng)參與學習記憶形成的重要腦區(qū)。BDNF是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子,被認為是記憶形成過程中的關鍵蛋白之一。BDNF發(fā)揮生物學效應主要有賴于和其特異性受體TrkB的結合。BDNF在海馬、大腦皮質的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞內合成、分泌,經(jīng)逆行運輸?shù)交浊澳X膽堿能神經(jīng)元的胞體,然后作用于膽堿能投射纖維終末的受體TrkB,形成配體-受體復合物,后者迅速激活酪氨酸激酶型受體,如胰島素受體(IR)、胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)等,再級聯(lián)激活下游信號轉導蛋白如MAPK、磷脂酰肌醇激酶(PI3-K)、磷脂酶C-γ(PLC-γ),啟動新的神經(jīng)元突觸的基因和蛋白的合成,從而發(fā)揮膽堿能神經(jīng)元的功能并能夠維持神經(jīng)元的存活,挽救神經(jīng)元變性等作用[3,6,7,8,9,10,11,12,13,14]。Mizuno等實驗提出BDNF-TrkB信號通路與NMDA受體存有內在聯(lián)系,這種聯(lián)系在海馬空間記憶中起到了重要作用。衰老的顯著特征之一是隨增齡學習記憶功能逐漸減退。海馬是學習記憶的關鍵部位,又是最易受衰老影響的腦區(qū)之一。目前有關于衰老有許多學說,如GC(糖皮質激素)毒性學說等。資料表明,欲研究與年齡相關的記憶退化分子機制,海馬的L-LTP是最為可信的。在老年大鼠,記憶和LTP與相關蛋白合成下降有關。也有學者認為,衰老與蛋白激酶、磷酸化酶活性失衡有關,進而導致L-LTP受損和影響長時程記憶。中醫(yī)認為,腎主骨生髓,腦為髓之海。清代王清任說:“人之靈機記憶皆在于腦”。表明腎與腦的記憶功能關系密切。明代醫(yī)家張景岳所創(chuàng)的左歸丸、右歸丸是滋補腎陰、溫補腎陽的名方。近年來本課題組根據(jù)中醫(yī)衰老腎虛理論,以自然衰老大鼠為腎虛模型,觀察了大鼠大腦邊緣系統(tǒng)海馬和杏仁核對下丘腦-垂體-腎上腺-胸腺(HPAT)軸調節(jié)的增齡性變化及左歸丸與右歸丸的調整作用。實驗表明補腎方藥左歸丸、右歸丸可影響老年大鼠大腦邊緣系統(tǒng)(海馬、杏仁核)對HPAT軸的調控作用,糾正老年大鼠神經(jīng)內分泌功能的異常變化,進而有助于延緩衰老。故本實驗在以往工作基礎上,又觀察了左歸丸、右歸丸對衰老大鼠學習記憶形成過程中的相關基因一BDNF及其受體TrkB的影響。通過原位雜交實驗,并進行統(tǒng)計分析,表明老年大鼠海馬各分區(qū)BDNFmRNA及TrkBmRNA表達明顯減弱。海馬CA1區(qū)、CA2區(qū)和CA3區(qū)存在大量錐體細胞,屬于膽堿能神經(jīng)通路的組成結構。有報道提出,海馬CA1區(qū)錐體細胞層與片段式記憶、前后聯(lián)系、空間認知有關,在CA1區(qū)能誘導出穩(wěn)定的LTP,臨床上發(fā)現(xiàn)CA1區(qū)損傷的病人可以有嚴重的記憶缺陷,LTP受損可能是通過損害了CA1區(qū)錐體細胞層而產(chǎn)生的;CA3區(qū)與空間聯(lián)想、空間完成、檢測新奇事物有關;而DG區(qū)與CA3區(qū)密切相關。補腎方藥左歸丸、右歸丸可以通過糾正相關基因的異常表達改善老年大鼠的學習記憶功能。它們在DG區(qū)的作用比較明顯,而在其他區(qū)則有不同程度的改