n-乙?；磻?yīng)制備殼聚糖脫乙酰度的研究

殼聚糖的制備地殼聚糖是通過脫乙?；玫降陌被崽恰Ｓ捎谄淞己玫纳镞m應(yīng)性和抗生物降解性，它被廣泛應(yīng)用于生物材料領(lǐng)域，如藥物釋放和組織結(jié)構(gòu)。在殼聚糖的研究中發(fā)現(xiàn),殼聚糖分子鏈中的脫乙酰度(DD)是影響殼聚糖性質(zhì)的主要因素之一,它與殼聚糖的pKα值、溶解性、結(jié)晶度、生物降解性等密切相關(guān)。在實際應(yīng)用中,也經(jīng)常根據(jù)要求,需要不同脫乙酰度的殼聚糖。制備不同DD的殼聚糖一般有兩種方法:一是甲殼素在濃堿作用下可部分或完全脫去N原子上的乙酰基,由于脫乙酰反應(yīng)在較高溫度和濃堿存在下進行,殼聚糖分子鏈易發(fā)生斷裂,同時反應(yīng)進行程度的控制較難;二是將由方法一得到的高DD殼聚糖與乙酸酐在室溫下進行N-乙?；磻?yīng),DD可以通過調(diào)整加入的乙酸酐的量來控制,反應(yīng)條件溫和,基本不影響殼聚糖分子鏈。因此一般采用方法二來制備各種不同DD的殼聚糖。本文使用的不同DD的殼聚糖樣品即是通過殼聚糖的N-乙?；磻?yīng)得到。運用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)和X射線衍射(XRD)分別研究了不同DD的殼聚糖的紅外光譜特性和結(jié)晶性,并分別確定了樣品的DD和結(jié)晶度,探討了N-乙?；潭葘ぞ厶荄D以及結(jié)晶度的影響。1材料和方法1.1紅外光譜測試殼聚糖(浙江玉環(huán)海洋生物化學(xué)制品有限公司,DD93.5%,分子量83.6kD);乙酸酐、甲醇、氫氧化鈉為分析純,使用前未經(jīng)進一步純化。冷凍干燥機(北京博醫(yī)康);傅里葉變換紅外光譜儀(Bruker);X射線衍射儀(Rigaku)。1.2殼聚糖的制備殼聚糖的N-乙?；磻?yīng)根據(jù)文獻,將2g殼聚糖溶于50mL2%(φ)醋酸溶液,緩慢攪拌溶解,然后加入50mL甲醇,得到均勻透明的微黃色溶液。然后加入一定量的乙酸酐,在室溫下攪拌反應(yīng)過夜。加入1mol·L-1NaOH溶液沉淀出溶液中的殼聚糖,過濾,洗滌至中性,冷凍干燥,即可得到不同DD的殼聚糖。經(jīng)200目過篩后,于干燥器中保存?zhèn)溆谩?.3紅外光譜分析將得到的殼聚糖粉末與充分干燥后的KBr混合研磨,壓片,在BrukerVector22紅外光譜儀上記錄殼聚糖的紅外光譜圖。殼聚糖材料的DD可用如下公式計算DD=(1?1.15×A1655/A3450)×100%DD=(1-1.15×A1655/A3450)×100%其中A1655為1655cm-1處的吸收強度,A3450為3450cm-1處的吸收強度。1.4殼聚糖的結(jié)構(gòu)表征將得到的殼聚糖粉末在RigakuD/max-rCX射線衍射儀上掃描,電壓40kV,電流25mA,CuKα譜線(λ=0.15418nm),掃描范圍5～40°,掃描速度2°·min-1?？傻玫絅-乙?；潭炔煌臍ぞ厶堑腦射線光譜圖。其結(jié)晶指數(shù)(CrI)可用下列公式計算CrI%=(I110?Iam)/I110×100%CrΙ%=(Ι110-Ιam)/Ι110×100%其中I110為20°處殼聚糖110晶面的最大衍射強度,Iam為16°處殼聚糖無定形區(qū)的衍射強度。2結(jié)果與討論2.1殼聚糖的n-乙?；磻?yīng)在殼聚糖的紅外光譜圖中,比較特征的有3450cm-1左右由O—H的伸縮振動吸收峰和N—H的伸縮振動吸收峰重疊而成的一個寬峰,2920cm-1附近有甲基或次甲基的C—H伸縮振動吸收峰。此外由于殼聚糖分子中含有一定量的乙酰氨基,所以還有酰胺(NHCO)的三個特征吸收峰,分別是1650cm-1(酰胺Ⅰ)、1550cm-1(酰胺Ⅱ)和1310cm-1(酰胺Ⅲ),以及氨基(—NH2)在1600cm-1附近的特征吸收譜帶。殼聚糖是由甲殼素經(jīng)脫乙酰反應(yīng)得到,但由于分子中的乙酰氨基很難完全脫除,所以在殼聚糖中往往同時存在氨基和乙酰氨基。在脫乙酰度較高(DD>90%)的殼聚糖中,氨基的特征譜線1600cm-1非常明顯,而乙酰氨基的三個酰胺譜線則非常微弱,僅在1650cm-1(酰胺Ⅰ)有一個稍稍突起的小峰(見圖1a)。當(dāng)用乙酸酐對殼聚糖進行乙?；瘯r,在含有50%甲醇的醋酸溶液中,反應(yīng)一般發(fā)生在氨基上,乙酰化的程度可以通過反應(yīng)中添加的乙酸酐的量來控制。隨N-乙?；磻?yīng)的進行,殼聚糖的紅外譜圖中比較明顯的變化就是1650cm-1(酰胺Ⅰ)吸收強度增加,有非常明顯的吸收峰出現(xiàn),而且其強度隨反應(yīng)中添加的乙酸酐量的增加而逐步增大,同時1600cm-1處氨基的吸收強度有所減小(見圖1b-圖1f)。用Kurita等提出的公式計算其脫乙酰度(DD),將由此計算得到的DD與反應(yīng)時添加的乙酸酐量關(guān)聯(lián),即可得到如圖2所示的曲線。由該曲線可知,隨著反應(yīng)中添加的乙酸酐量的增加,殼聚糖的DD逐漸減小。在開始階段,二者呈線性關(guān)系,但當(dāng)殼聚糖的DD降低到約60%以后,該曲線下降趨勢逐步平緩,這表明殼聚糖分子中的部分氨基的N-乙酰化變得困難起來。這是由于殼聚糖分子中存在非定形區(qū)和較規(guī)整的結(jié)晶區(qū),乙酸酐與非定形區(qū)的氨基反應(yīng)較為容易,而與結(jié)晶區(qū)的氨基反應(yīng)需要克服晶格能,反應(yīng)速度降低。2.2殼聚糖的n-乙酰化過程由殼聚糖粉末的X射線衍射譜圖(見圖3)可以看到殼聚糖具有兩種不同的晶體形態(tài),均屬于單斜晶系。根據(jù)Samuels等的研究結(jié)果,殼聚糖的這兩種晶形分別稱為FormⅠ(2θ在10°左右)和FormⅡ(2θ在20°左右)。如圖3a所示,DD為93.5%的原料殼聚糖僅在20.6°有明顯的衍射峰,表明原料殼聚糖粉末中只有FormⅡ一種晶形存在。當(dāng)殼聚糖分子中的氨基被乙?；瘯r,該衍射峰的強度逐漸降低(見圖3b～圖3e),顯然乙酰基的引入改變了殼聚糖分子的結(jié)構(gòu),降低了結(jié)構(gòu)的有序性。同時隨著乙?；潭鹊脑黾?殼聚糖分子中出現(xiàn)FormⅠ晶形。當(dāng)殼聚糖的DD從81.7%降到52.6%時,FormⅠ晶形的衍射峰從11.8°遷移到8.8°,其d間距值和強度也不斷增大(見表1和圖3b-圖3f)。這表明伴隨著殼聚糖的N-乙酰化,一種新的晶形逐步形成。殼聚糖的N-乙酰化過程不僅是其化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化,同時也伴隨著物理結(jié)構(gòu)的改變。如圖4,可以看到原料殼聚糖結(jié)構(gòu)較為規(guī)整,結(jié)晶度很高(CrI=62.2%)。隨著DD的降低,也就是乙酰氨基的增加,破壞了其結(jié)構(gòu)的規(guī)整性,結(jié)晶度不斷降低,當(dāng)DD為56.1%時,CrI降至44.3%。但是隨著乙酰氨基的增多,形成的乙酰氨基葡萄糖單元開始形成彼此有序的結(jié)構(gòu)(FormⅠ晶形),結(jié)晶度開始增加。因此當(dāng)DD進一步降低為52.6%時,其結(jié)晶度反而增加(CrI=59.5%)。由圖5的示意圖也可以看出,殼聚糖的DD大于90%時,殼聚糖分子中大部分是由氨基葡萄糖單元形成的結(jié)晶區(qū),結(jié)構(gòu)非常規(guī)整。當(dāng)殼聚糖的氨基被部分N-乙?；瘯r,由于反應(yīng)在均相條件下進行,在殼聚糖分子鏈上的取代部位較均勻,導(dǎo)致氨基葡萄糖單元形成的結(jié)晶區(qū)被不斷破壞,結(jié)構(gòu)的規(guī)整度不斷下降。當(dāng)N-乙酰化繼續(xù)進行,至DD約為50%時,反應(yīng)生成的N-乙酰氨基葡萄糖單元數(shù)量不斷增加,同時開始形成新的不同的結(jié)晶區(qū)。殼聚糖對于生物醫(yī)學(xué)是一種有應(yīng)用價值的材料,所以本工作的研究很有意義,得到一些新的成果。近來也有這方面的報道。3殼聚糖的n-乙酰化反應(yīng)殼聚糖的N-乙?；Ｓ脕碇苽洳煌珼D的殼聚糖。通過FTIR計算DD,發(fā)現(xiàn)隨N-乙酰程度的增加,剩余氨基的反應(yīng)