補(bǔ)中益氣湯對脾胃虛證大鼠傷口愈合的影響及機(jī)制研究

傷口愈合的延遲不僅給患者帶來了痛苦，也是醫(yī)生面對的一個(gè)微妙問題。這是多因素綜合作用的結(jié)果?，F(xiàn)代傷口愈合延遲的治療原則是傷口局部清潔和抗感染，效果不明顯。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為肌肉是由脾所主,則傷口不能正常愈合的原因在于“脾”功能異常。所以從“脾主肌肉”理論出發(fā),選用補(bǔ)脾代表方補(bǔ)中益氣湯用于實(shí)驗(yàn)研究。本研究通過大鼠脾氣虛模型的建立和手術(shù)傷口的制作,并用補(bǔ)中益氣湯進(jìn)行干預(yù),觀察傷口局部肌肉組織羥脯氨酸(Hyp)的濃度和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的相對表達(dá)量,探討補(bǔ)中益氣湯對傷口愈合的影響以及其作用機(jī)制,以達(dá)到對傷口愈合從脾進(jìn)行論治的目的。1材料表面1.1動(dòng)物或微生物指標(biāo)健康SPF級SD大鼠,雌雄各半,體重(210±10)g,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,動(dòng)物合格證號SCXK(京)2009-0004。1.2制備成水部分補(bǔ)中益氣湯(由黃芪18g,炙甘草9g,人參6g,當(dāng)歸3g,陳皮6g,升麻6g,柴胡6g,白術(shù)9g組成)和大黃由山西中醫(yī)學(xué)院第二中醫(yī)院提供,均常規(guī)煎煮,制備成水煎劑,質(zhì)量濃度均為1g·mL-1,低溫保存?zhèn)溆谩＆?SMA小鼠抗大鼠抗體(Sigma公司),VEGF小鼠抗大鼠抗體(SantaCruz公司),HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),全蛋白抽提試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司),Hyp試劑盒(南京建成生物工程研究所)。1.3面-nd-x-xr凝膠成像系統(tǒng)和轉(zhuǎn)膜儀SpectraMax190全波長酶標(biāo)儀(美國MD公司),GelDox-XR凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司),3k30臺式高速冷凍離心機(jī)(德國SIGMA公司),TE70PWR轉(zhuǎn)膜儀(美國Amersham公司),BS224S型電子天平(德國賽多利斯集團(tuán))。2方法2.1市場苦寒瀉下法建立氣功虛動(dòng)物模型60只SD大鼠隨機(jī)分為3組:正常組、脾氣虛模型組、補(bǔ)中益氣湯組,各組又分為術(shù)后3d和術(shù)后7d2個(gè)亞組,各亞組10只SD大鼠。根據(jù)李東垣《脾胃論》中“苦寒之藥損其脾胃”的記載,應(yīng)用苦寒瀉下法建立脾氣虛動(dòng)物模型。脾氣虛模型組和補(bǔ)中益氣湯組SD大鼠每日灌服生大黃煎劑20g·kg-1,每天2次,連續(xù)灌胃18d。正常組SD大鼠給予等體積蒸餾水。2.2普通血藥濃度計(jì)算大鼠sd大鼠的研制項(xiàng)目采用最短紗制作工藝第18天SD大鼠背部剪毛,10%硫化鈉脫毛。第19天3組均制作手術(shù)傷口:術(shù)前禁食12h,以戊巴比妥鈉45mg·kg-1ip麻醉大鼠,常規(guī)消毒后于背部脊柱旁開1cm處平行脊柱做長約4cm的切口,切開皮膚深達(dá)肌層,傷口用3-0絲線縫合后用無菌紗布包扎,每日更換紗1次,至術(shù)后3d或7d。行手術(shù)切口當(dāng)天起,補(bǔ)中益氣湯組SD大鼠每日ig7g·kg-1的補(bǔ)中益氣湯(按體表面積折算,相當(dāng)于成人臨床用量),每天2次,連續(xù)給藥至大鼠處死之日。正常組和脾氣虛模型組SD大鼠給予等體積蒸餾水。末次灌胃6h后處死大鼠。2.3指標(biāo)和方法的檢測2.3.1病例對照處理取3大組術(shù)后3,7d大鼠各10只,在戊巴比妥鈉45mg·kg-1ip麻醉下處死,取距切口兩側(cè)各0.3cm、長3.0cm肌肉樣本。液氮條件下研磨肌肉組織,取一部分粉末稱重,采用堿水解法檢測其所含的羥脯氨酸含量,具體操作參照試劑盒說明書。在波長550nm處測定吸光度(A),計(jì)算公式為:2.3.2sds-采用分離蛋白檢測蛋白質(zhì)另取一部分肌肉粉末、稱重,按全蛋白抽提試劑盒提取各組肌肉組織的總蛋白,收集上清,-70℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肂raford法測定蛋白質(zhì)濃度,以此取等量蛋白質(zhì)上樣用于跑SDS電泳,經(jīng)過5%積層膠和12%分離膠電泳分離蛋白質(zhì)。將分離后蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉在搖床上室溫封閉2h,TBST漂洗膜3次。一抗4℃搖床孵育過夜,TBST漂洗膜3次。二抗室溫?fù)u床孵育1h,TBST充分漂洗,加入ECL液反應(yīng)顯影、曝光。用凝膠成像系統(tǒng)自帶軟件來定量檢測蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量,以正常組術(shù)后3d為比較基準(zhǔn),數(shù)據(jù)均用內(nèi)參GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)均以ue0af±s表示。多組間差異比較采用單因素方差分析,P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1大鼠一般情況灌服大黃后第2天多數(shù)大鼠泄瀉、便形質(zhì)軟或溏稀,肛周紅且有污物,第3天起逐漸出現(xiàn)大鼠食量減少、體重減輕,懶動(dòng)、蜷縮、弓背、瞇眼,喜扎堆,易驚,毛污黃無光澤、毛粘成縷狀甚至稀疏,10d以后表現(xiàn)出行動(dòng)緩慢、嗜睡、精神萎靡、明顯消瘦、久瀉不止甚至有脫肛現(xiàn)象,符合脾氣虛癥。3.2模型組和補(bǔ)中益氣湯組hyp含量比較與正常組術(shù)后3d比較,模型組和補(bǔ)中益氣湯組術(shù)后3d的大鼠Hyp含量均顯著降低(P<0.01和P<0.05)。與正常組術(shù)后7d比較,模型組術(shù)后7d的Hyp含量顯著降低(P<0.01);而補(bǔ)中益氣湯組術(shù)后7d的Hyp含量無顯著差別。與模型組術(shù)后3d比較,補(bǔ)中益氣湯組術(shù)后3d的Hyp含量顯著升高(P<0.01);術(shù)后7d的補(bǔ)中益氣湯組較模型組相比,也呈現(xiàn)顯著升高(P<0.01),見表1。3.3各組大鼠血清vegf,-sma的相對表達(dá)量術(shù)后3d各組間的結(jié)果比較:與正常組比較,模型組大鼠VEGF,α-SMA相對表達(dá)量均明顯降低(均P<0.01),補(bǔ)中益氣湯組大鼠VEGF,α-SMA相對表達(dá)量也均顯著降低(均P<0.05);與模型組比較,補(bǔ)中益氣湯組VEGF,α-SMA相對表達(dá)量顯著增加(P<0.01,P<0.05)。術(shù)后7d各組間的結(jié)果比較:與正常組比較,模型組VEGF,α-SMA相對表達(dá)量均明顯降低(均P<0.01),而補(bǔ)中益氣湯組VEGF,α-SMA相對表達(dá)量的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型組比較,補(bǔ)中益氣湯組VEGF,α-SMA相對表達(dá)量呈現(xiàn)明顯增加(P<0.05,P<0.01),見圖1,表1。4補(bǔ)中益氣湯干預(yù)氣功虛大鼠口服愈合的作用《素問集注·五臟生成》中說“脾主運(yùn)化水谷之精,以生養(yǎng)肌肉,故主肉”;《四圣心源》中說“肌肉者,脾土之所生也,脾氣盛則肌肉豐滿而充實(shí)”。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為:脾氣盛,則脾所運(yùn)化的水谷精微能正常營養(yǎng)肌肉,肌肉才能發(fā)達(dá)、健壯;反之肌肉得不到滋養(yǎng),因而可能出現(xiàn)傷口愈合延遲或經(jīng)久不愈的現(xiàn)象。補(bǔ)中益氣湯出自李東垣《脾胃論》,當(dāng)脾胃虛弱,受納和運(yùn)化都不足,故應(yīng)當(dāng)補(bǔ)之,方中諸藥合用,具有補(bǔ)中益氣、升陽舉陷的療效。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究,也已經(jīng)多方面證實(shí)補(bǔ)中益氣湯能明顯改善脾氣虛證。在傷口愈合過程中,膠原蛋白由肉芽組織中的成纖維細(xì)胞合成和分泌,與其他成分共同作用以能修復(fù)組織的結(jié)構(gòu)、改善組織的強(qiáng)度。除彈性蛋白含少量Hyp外,Hyp主要存在于膠原蛋白中,且含量穩(wěn)定。有研究報(bào)道,大鼠組織膠原蛋白中的羥脯氨酸含量為9.2%。因此檢測組織中羥脯氨酸的含量,可以反映創(chuàng)傷愈合的情況。α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)記物,只出現(xiàn)在正常組織的血管平滑肌細(xì)胞和肌肉組織中。在傷口愈合時(shí),肉芽組織中豐富的肌成纖維細(xì)胞通過其細(xì)胞骨架成分α-SMA的收縮,促進(jìn)傷口的收縮,皮緣靠攏,從而閉合傷口。肉芽組織中血管再生是多因素參與的過程,目前已經(jīng)明確有多個(gè)血管形成刺激因子均能促進(jìn)血管生成,VEGF是其中關(guān)鍵因子之一。VEGF在傷口局部的濃度明顯增高,與傷口部位肉芽組織的形成有關(guān);其具體作用是增加傷口部位通透性、刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖,誘導(dǎo)血管生成,促進(jìn)創(chuàng)面愈合。本研究用補(bǔ)中益氣湯干預(yù)脾氣虛癥大鼠的傷口愈合,實(shí)驗(yàn)說明補(bǔ)中益氣湯通過提高Hyp,VEGF,α-SMA的量可有效促進(jìn)傷口的愈合。術(shù)后3d補(bǔ)中益氣湯組3項(xiàng)指標(biāo)雖然高于術(shù)后3d模型組,但是仍然低于術(shù)后3d正常組;表明用補(bǔ)中益氣湯干預(yù)脾氣虛大鼠3d,可促進(jìn)傷口的愈合但仍