培養(yǎng)基（1）細菌培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基（1L）：5g酵母提取物，10g氯化鈉，10g胰蛋白胨，pH7.0；SOB培養(yǎng)基（1L）：5g酵母提取物，0.5g氯化鈉，20g胰蛋白胨，2.5mL1M氯化鉀，pH7.0,高壓滅菌后在每100mL的小份中加1mL1M氯化鎂。（2）酵母生長培養(yǎng)基100mLYPD培養(yǎng)基：1g酵母提取物，2g胰蛋白胨，0.02mL10MNaOH，雙蒸水95mL,固體加2g瓊脂粉。高壓后加入5mL40%葡萄糖；100mLYPDA培養(yǎng)基：基本配方同上。高壓后加入0.8mL100xAde和5mL40%葡萄糖；100mLSD/-Leu培養(yǎng)基：0.7g無氨基酵母氮源，0.07g四缺物,0.02mL10MNaOH，雙蒸水95mL，固體加2g瓊脂粉。高壓后加入0.8mL100xAde,5mL40%葡萄糖，0.2mL500xTrp和0.2mL500xHis。100mLSD/-Trp培養(yǎng)基：0.7g無氨基酵母氮源，0.07g四缺物,0.02mL10MNaOH，雙蒸水95mL，固體加2g瓊脂粉。高壓后加入0.8mL100xAde，5mL40%葡萄糖，1mL100xLeu和0.2mL500xHis；100mLSD/-Trp/-Ade培養(yǎng)基:基本成分同上。高壓后加入5mL40%葡萄糖,1mL100xLeu和0.2mL500xHis；100mLSD/-Trp/-His培養(yǎng)基：基本成分同上。高壓后加入0.8mL100xAde，5mL40%葡萄糖和1mL100xLeu；100mLSD/-Trp/-Leu培養(yǎng)基：基本成分同上。高壓后加入0.8mL100xAde，5mL40%葡萄糖和0.2mL500xHis；100mLSD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培養(yǎng)基：基本成分同上。高壓后加入5mL40%葡萄糖。其中，100xAde：1gAdeninehemisulfate/200mL雙蒸水；500xTrp：1gTryptophan/100mL雙蒸水；500xHis：1gHistidine/100mL雙蒸水；100xLeu：1gLeucine/100mL雙蒸水中。（3）緩沖液體積緩沖液配制10XTE100mLTris1.21g；EDTANa2?2H2O0.37g；ddH2O80mL；鹽酸調(diào)pH7.5；ddH2O定容。10XLiAc100mLLiAc?2H2O10.20g；ddH2O50mL，冰醋酸調(diào)pH7.5；ddH2O定容。50%PEG100mLPEG335050.0g；ddH2O定容。1制備酵母感受態(tài)細胞（1） 在YPDA平板上劃線培養(yǎng)Y187細胞，30°C條件下培養(yǎng)一周左右，待單菌落長到直徑5~6mm后，挑取單菌落接種到3mLYPDA液體培養(yǎng)基中，30C條件下200rpm振蕩培養(yǎng)8h；（2） 取5iL菌液加入50mLYPDA液體培養(yǎng)基中（按1：10的比例），250rpm振蕩培養(yǎng)16~20h，直至OD6o（達到0.15?0.3；菌液在10°C下2000rpm離心5min；棄上清，加入100mLYPDA液體培養(yǎng)基重懸細胞；在30C靜置培養(yǎng)3-5h,直至OD600達到0.4?0.5(不能超過0.6)；菌液在10C下2000rpm離心5min；棄上清，加入6mL(1/6體積)1xTE重懸細胞(可吹打數(shù)次)；在10C下2000rpm離心5min,重復7-8一次；棄上清，加入400此lxTE/LiAc混合液懸浮細胞，放在冰上；注：1xTE/LiAc混合液(新鮮配制)：1mL10xTE+1mL1MLiAc，用去離子水定容至10mL。將細胞懸浮液按100yL分裝至1.5mLEppendorf管。2酵母轉化(BD、pGBKT7)將10yLHerringDNA煮沸15min,冰浴，加入50mL離心管中。向離心管中加入100yL的感受態(tài)細胞，再加入4yLBD質粒，輕輕混勻；加入600yLPEG/LiAc溶液，輕輕渦旋混勻；注：2.5mLPEG/LiAc：2000卩L50%PEG3350+250卩L10xLiAc+250卩L10xTE，渦旋10s混勻。30C，200rpm培養(yǎng)30min；加入70yLDMSO,混勻，將離心管放在42C水浴15min，期間混勻一次；冰浴2min；10C，14000rpm離心5s,棄上清；用0.5mL1XTE懸浮細胞；涂板(SD-Trp,SD-Trp-Leu),100yL/皿,30C黑暗倒置培養(yǎng)3-4天。隨機挑取SD/-Trp平板上的若干單克隆提取酵母質粒(YPDA培養(yǎng)基搖菌)，用BD引物克隆子中重組質粒的存在。1.2.1.2重組質粒對Y187細胞毒性檢測通過比較含有pRABD1重組質粒的酵母菌及含有pGBKT7空載體的酵母菌在SD/-Trp培養(yǎng)基中的生長情況，來檢測重組質粒的表達產(chǎn)物對細胞是否有毒性。分別挑取單菌落接種于50mL的SD/-Trp/Kan(50yg/mL)液體培養(yǎng)基中，于30C,180rpm振蕩培養(yǎng)18~24h，再用紫外分光光度計檢測OD600。如果OD600遠小于0.8,說明重組質粒的表達產(chǎn)物對細胞可能有毒性。1.2.1.3重組質粒的自激活活性檢測挑取帶重組質粒的單個克隆溶于l0yL無菌水中，渦旋混勻，劃線接種于SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His平板上，檢測是否自激活報告基因ADE2和HIS3。同時也在SD/-Trp/X-a-Gal平板上劃線，檢測是否自激活報告基因MEL1。如果報告基因MEL1被激活，其表達產(chǎn)物％半乳糖苷酶在底物X-a-Gal存在的情況下呈藍色反應。檢測只有在SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His平板上菌落不能生長以及SD/-Trp/X-a-Gal平板上菌落為白色，才能證明重組質粒自身不能激活報告基因，可用于下面的篩選。1.2.2酵母交配取1mL含有文庫的AH109菌液(^2x107cells/i)于25C水浴鍋中慢慢溶解；上述的文庫與5mLBD的Y187菌液(>1x10cells/i)在2L的無菌三角瓶中混合，再加入45mL含有50“g/LKan的2XPDA液體培養(yǎng)基，輕輕渦旋混勻；30C,30-50rpm輕輕振蕩培養(yǎng)20-24h;交配20h后，在400倍的顯微鏡下觀察培養(yǎng)液中酵母交配情況，如果出現(xiàn)接合子，就繼續(xù)交配4個多小時，也可進行下一步；收集交配液于50mL的離心管中，1000x離心10min;用50mL含有50“g/LKan的0.5XPDA潤洗交配瓶兩次；離心完，棄上清，用第(6)步中的潤洗液重懸菌體，1000X?離心10min;棄上清，取10mL含有50“g/LKan的0.5XPDA重懸菌體，同時測量一下這個重懸液的體積。1.2.3酵母雙倍體的篩選將交配液涂布在SD/-His/-Leu/-Tr平板上(200“/150mm平板)，30C培養(yǎng)，直至菌落出現(xiàn)；觀察菌落生長情況。培養(yǎng)2~4d后，可在平板上觀察到一些Ade+/His陽性菌落，繼續(xù)培養(yǎng)至第10d以保證具有微弱互作陽性菌落的生長。如果第(1)步是涂布在SD/-His/-Leu/-Tr平板上，就將該平板上的陽性菌落轉印至SD/-Ade/-His/-Leu/-T平板上，檢測報告基因ADE2和HIS3的激活情況；30?繼續(xù)培養(yǎng)4~6d后，挑取假定的陽性克隆子(Ade+/His)至凍存培養(yǎng)基中，并凍存于-80C以備進一步驗證；1.2.4互作陽性克隆子的驗證及測序1.2.4.1互作克隆子的重復驗證挑取假定的互作克隆子重新涂布至SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp+10mM3-平板上作重復驗證；注：當使用HIS3作為報告基因時，該基因存在一定程度的泄漏表達，可能導致高背景的現(xiàn)象，這時可使用適量的HIS3蛋白競爭性抑制劑3-AT(3-amino-1,2,4-triaZo以降低背景。然后將克隆子涂布至SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/XGal平板上檢測報告基因MEL1的激活情況。30?培養(yǎng)2~4d挑取顯藍色的陽性克隆子作進一步分析；挑取第(2)步中得到顯藍色的互作克隆子重新接種到新鮮的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/XGal平板上，作重復驗證。1.2.4.2互作克隆子cDNA片段的驗證取經(jīng)重復驗證過的單個互作克隆于5mLYPDA培養(yǎng)基中30C，250rpm振搖12~16hr提取酵母質粒；以酵母質粒作模板，用AD載體通用引物MATCHMAKERADLD-Insertprimer(P1F和P1R)對其進行PCR擴增，檢測cDNA片段的大小。排除那些無插入片段、插入片段較小(<200bp,pGADT7-Rec空載體PCR擴增產(chǎn)物約為200bp)以及多個插入片段的克隆，保留含有單一較大cDNA插入片段的質粒作進一步驗證。1.2.4.3互作克隆子的回復雜交驗證1.2.4.3?1制備大腸桿菌DH5a超級感受態(tài)細胞LB平板上活化細菌菌株，37°C培養(yǎng)過夜；挑單菌落接種至4mL液體LB培養(yǎng)基，37C培養(yǎng)過夜；按2%接種量擴大培養(yǎng)至200mL液體SOB培養(yǎng)基，20C，100rpm培養(yǎng)至ODg。。為0.4?0.6(約8h)；(4)冰上10min；將菌液移至離心管，4C，2000xg離心20min,棄上清；用40mL預冷的轉化緩沖液重懸沉淀；注：轉化緩沖液（100mL）：10mMPIPES+15mMCaC^dHzO+250mMKCl+55mMMnC—(7)冰上10min，重復步驟(5)；(8)用18.6mL預冷的轉化緩沖液輕輕重懸沉淀，然后緩慢攪拌并逐滴加入1.4mLDMSO；(9)冰上5min，每管100吐分裝，液氮速凍，于-80C保存。1.2.4.3.2酵母質粒轉化細菌將含有cDNA插入片段的酵母質?；旌衔?BD/Rac1+AD/cDNA)用熱激法轉化DH5a超級感受態(tài)細胞：取5此質粒加入100吐感受態(tài)細胞，輕輕混勻，冰上放置30min；將反應管快速轉移至42C水浴中，熱擊90s；(3)冰上2min；加入500吐液體LB培養(yǎng)基；37C，150rpm復蘇1.5h；取100此菌液涂布于LB(含100卩g/mLAmp)平板。注:LB平板中的抗生素與AD-cDNA質粒所帶的抗性(Amp)一致，這樣最終篩選到的克隆只含有AD-cDNA質粒。1.2.4.3.3互作克隆子cDNA片段的重復驗證分別挑取多個單菌落于5mLLB培養(yǎng)基(含100卩g/mLAmp)中，37C，250rpm振搖12~16h,以菌液為模板，用pGADT7-Rec載體通用引物P1F和P1R進行PCR擴增，驗證cDNA片段的大小是否與從酵母質粒中擴增的片段大小一致。選取大小一致的含有AD-cDNA質粒的陽性克隆保存菌液，并用堿裂解法提取細菌質粒。1.2.4.3.4互作克隆子的雙雜交驗證將互作克隆子的細菌質粒分別與正顯性激活型MoRac1-BD誘餌重組質粒pRABD1共轉化酵母AH109的感受態(tài)細胞，在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X--Gal平板上進行回復驗證，經(jīng)驗證仍可生長且顯色的即為陽性克隆子。1.2.4.4陽性克隆子cDNA片段的測序接種陽性克隆菌液至新鮮的5mLLB培養(yǎng)基(含100Mg/mLAmp中，37°C,250rpm振搖12?16h,保存菌液，并用T7通用引物進行序列測序；在“Magnaportheoryzae”數(shù)據(jù)庫中用Blastn比對測序結果，獲得同源序列及注釋信息，進而分析陽性克隆中cDNA片段大小、閱讀框方向、序列完整性及蛋白信息。1.2.13.7過氧化物含量檢測稻瘟病菌菌株接種CM固體培養(yǎng)基，26C培養(yǎng)2d后，將無菌蓋玻片斜插入菌落外緣；26C繼續(xù)培養(yǎng)2~4d后，菌絲蔓延至蓋玻片上；直接取出蓋玻片，用0.6mMNBT(氮藍四唑)染色2h后，用無水乙醇終止反應；在ZeissAxiovert200Mconfocal顯微鏡明場下觀察菌絲端部甲瓚(f