川芎嗪抗血栓作用及機(jī)制研究

高血壓的形成是西方國(guó)家發(fā)病率和死亡率的主要原因。但目前抗血栓藥物種類有限,且肝素類多需注射,華法林又需臨床監(jiān)測(cè)不能滿足臨床需求。川芎嗪是從中藥川芎根莖中提取的有效成分,具有活血、化瘀、理氣功能,擴(kuò)張小血管和改善微循環(huán)的作用,臨床上廣泛用于治療缺血性腦血管疾病,并取得較好療效。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)對(duì)川芎嗪的研究主要集中在腦缺血的治療及體外抗血小板聚集上,未見(jiàn)對(duì)在體動(dòng)靜脈血管血栓的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究川芎嗪在體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)靜脈血栓模型中抗血栓形成的能力,通過(guò)測(cè)定抗血小板聚集活性、與凝血酶親和力和凝血指標(biāo)凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT),探討其抗血栓活性并推測(cè)其作用機(jī)制。1材料和方法1.1醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SD大鼠,雌雄各半,體重200~230g,由中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,合格證號(hào):SCXK(軍)2007-012。家兔40只,雄性,2.0~2.2kg,由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):SCXK(蘇)2008-0010。1.2藥物、試劑和儀器川芎嗪,由中國(guó)藥科大學(xué)藥物化學(xué)教研室提供;二磷酸腺苷(ADP),南京建成生物制品研究所;凝血酶,湖南一格制藥有限公司;膠原,Sigma公司;S-2238,Anaspec公司;血塞通片劑,云南玉溪維和制藥有限公司;聚桂醇,陜西天宇制藥有限公司;PT、APTT測(cè)定試劑,太陽(yáng)生物科技有限公司。1.3儀器、檢測(cè)方法SC-2000血小板聚集測(cè)試儀(北京賽科希德科技發(fā)展有限公司);TG1650-WS臺(tái)式高速離心機(jī)(上海盧湘離心機(jī)有限公司);小動(dòng)物血栓生成儀(濟(jì)南益延科技開(kāi)發(fā)有限公司);BIO-RADModel680全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(上海瑞億儀器有限公司);半自動(dòng)凝血分析儀(南京瑞麥科技開(kāi)發(fā)有限公司)。1.4烏拉坦血栓模型的建立健康SD大鼠隨機(jī)分成5組,分別為正常對(duì)照組、血塞通組(80mg/kg)、川芎嗪低中高組(20、40、80mg/kg),每組8只,雌雄各半。連續(xù)灌胃給藥3d,最后一次給藥后1.5h后,腹腔注射烏拉坦(20%,5mL/kg)麻醉。打開(kāi)腹腔手術(shù)結(jié)扎大鼠下腔靜脈后,縫合腹壁,造大鼠下腔靜脈血栓模型,4h后重新打開(kāi)腹腔,在結(jié)扎下方2cm處用止血鉗夾住血管,然后縱行剖開(kāi)管腔觀察有無(wú)血栓形成,如有即取出血栓,用濾紙沾去血栓表面的浮血,置60℃烤箱烤20h,冷卻后稱血栓干重。藥物對(duì)血栓抑制率(%)=(空白組血栓重量-給藥組血栓重量)/空白組血栓重量×100%。1.6頸靜脈內(nèi)靜脈和面靜脈結(jié)合家兔分組及給藥同前,劑量調(diào)整為大鼠劑量的一半。給藥后1.5h后,戊巴比妥鈉麻醉,右側(cè)股動(dòng)脈插管。分離頸靜脈,暴露頸外靜脈和面靜脈二分叉處。結(jié)扎頸靜脈周圍小分支血管,動(dòng)脈夾夾閉兩端,保持封閉長(zhǎng)度為4cm。面靜脈遠(yuǎn)心段結(jié)扎,從面靜脈開(kāi)口,向頸靜脈血管中通過(guò)灌注0.5%聚乙二醇十二醚(5mg/mL)持續(xù)5min。處理后,吸出灌注液,用鹽水漂洗。結(jié)扎創(chuàng)口。取掉動(dòng)脈夾重新建立血流量25min后,分離血管片段,取出所有血栓,置60℃烤箱烤20h,冷卻后稱血栓干重。1.7貧血小板血漿prp和ppp的制備家兔給藥后2h,從右側(cè)股動(dòng)脈插管取血。全血按9∶1加入3.8%枸櫞酸鈉,混勻,800r/min離心10min,取上清,即為富血小板血漿(PRP);剩余血液繼續(xù)3000r/min離心10min,得貧血小板血漿(PPP)。用PPP調(diào)零,以PRP為血小板供體,每組6個(gè)平行樣。分別取200μLPRP,與不同濃度的受試藥溶液,37℃溫育1min后,分別加入ADP、凝血酶、膠原(終濃度分別為10μmol/L、1U/L、4mg/L),利用SC-2000血小板聚集儀描記血小板聚集曲線,記錄測(cè)定時(shí)間內(nèi)血小板最大聚集率。1.8凝血酶反應(yīng)tri-0.2mol/l抗凝血酶活性用生色底物S-2238測(cè)定。取7.5μL方法“1.7”中制取的PPP和30μL1mmol/LS-2238用87.5μL0.1μmol/LTri-0.2μmol/LNaCl緩沖液(pH=8.4)混合均勻。反應(yīng)從加入25μL0.1U/mL人凝血酶溶液開(kāi)始,混合物37℃孵育45min。加入100μL60%乙酸結(jié)束反應(yīng)。吸光度在405nm處測(cè)量?？鼓富钚?抑制率%)計(jì)算方法:抑制率=(1-抑制劑OD值)/生理鹽水OD值。1.9測(cè)量的父母和孩子1.10pss單因素方差分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用SPSS16.0軟件包進(jìn)行定量資料的單因素方差分析(OneWayANOVA),進(jìn)一步用q檢驗(yàn)比較組間差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1大鼠靜脈血栓模型川芎嗪對(duì)大鼠及家兔靜脈血栓模型均有較好的抑制作用,大鼠靜脈血栓模型中,川芎嗪各劑量組與空白組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而家兔非閉塞性血栓模型中只有高中劑量組與空白組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表1。2.2川評(píng)論員對(duì)血小板聚集的影響由表2可見(jiàn),川芎嗪對(duì)ADP、凝血酶、膠原誘導(dǎo)的血小板聚集都有抑制作用,且在相同劑量下川芎嗪對(duì)ADP,凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集較膠原誘導(dǎo)的血小板聚集抑制效果好。2.3川芎嗪一從高劑量下合成了通血流量的測(cè)定,在測(cè)定時(shí)間內(nèi)測(cè)定總動(dòng)脈的血流量小川芎嗪能有效地抑制電刺激動(dòng)脈血栓的形成,且高劑量下川芎嗪在測(cè)定時(shí)間內(nèi)的血流量為空白組的1.9倍,較好地提高了通過(guò)頸總動(dòng)脈的血流量。結(jié)果見(jiàn)圖1。2.4氯乙醇對(duì)pt、abt和凝血酶濃度的影響川芎嗪各劑量組對(duì)凝血酶均有抑制作用,相同劑量下川芎嗪對(duì)凝血酶的抑制率為血塞通的5.8倍,且對(duì)PT的延長(zhǎng)大于APTT。結(jié)果見(jiàn)表3。3川浚嗪的降血作用川芎嗪是傘形科植物川芎中分離提純的生物堿單體,是中藥川芎的主要有效成分,具有擴(kuò)張血管、增加腦血流量和活血化淤作用。川芎嗪被廣泛用于閉塞性腦血管疾病如腦供血不足、腦血栓形成、腦栓塞等。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)從動(dòng)靜脈血栓形成及與凝血相關(guān)因子方面考察川芎嗪的抗血栓活性,進(jìn)一步闡明川芎嗪的抗血栓作用。體內(nèi)血小板實(shí)驗(yàn)中,川芎嗪對(duì)ADP、凝血酶和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集均有不同程度的抑制作用,且對(duì)ADP和凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集抑制作用顯著。進(jìn)一步的凝血酶抑制率實(shí)驗(yàn)表明川芎嗪對(duì)凝血酶有一定的親和力,但抑制率較低(40mg/kg時(shí)抑制率為18.4%),表明川芎嗪抗血小板聚集的機(jī)制除與凝血酶有一定親和力外還可能有其他途徑。大鼠下腔靜脈結(jié)扎和電刺激以及家兔靜脈血栓實(shí)驗(yàn)都是從刺激內(nèi)皮的角度激活凝血通路造成血栓。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明川芎嗪對(duì)以上3種模型均有抑制作用,川芎嗪對(duì)大鼠靜脈血栓形成的抑制率大于家兔靜脈血栓模型,推測(cè)可能是由于藥物在不同動(dòng)物體內(nèi)生物利用度不同導(dǎo)致的。同時(shí)川芎嗪對(duì)大鼠電刺激動(dòng)脈血栓形成的作用明顯,顯著地增加了通過(guò)頸總動(dòng)脈的血流量,由曲線下面積求出川芎嗪在20、40和80mg/kg劑量下18min內(nèi)血流量分別是空白組的1.3、1.6和1.9倍,較好地改善了大鼠的供血功能。而且川芎嗪對(duì)PT的延長(zhǎng)效果更加明顯,進(jìn)一步表明川芎嗪抗血栓是通過(guò)抑制外源性凝血途徑實(shí)現(xiàn)的,推測(cè)川芎嗪可能是通過(guò)保護(hù)內(nèi)皮功能抑制血栓形成的,這也與文獻(xiàn)報(bào)道的川芎嗪有內(nèi)皮保護(hù)作用一致。綜上所述,川芎嗪較好地抑制動(dòng)靜脈血栓的形成,結(jié)合凝血酶抑制率、血小板聚集和PT、APTT測(cè)定結(jié)果,推測(cè)川芎嗪抗血栓機(jī)制可能與多途徑抑制血小板聚集通路與保護(hù)內(nèi)皮有關(guān)。1.5時(shí)間-頸總血流量圖大鼠分組