Chapter５ModificationofEnzymeMolecule酶分子的修飾

雖然酶已在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和環(huán)保方面得到了越來(lái)越多的應(yīng)用，但就總體而言，大規(guī)模應(yīng)用酶和酶工藝的尚不夠多。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因很多，其中酶自身在應(yīng)用上暴露出來(lái)的一些缺點(diǎn)是最根本的原因。

酶一旦離開(kāi)生物細(xì)胞離開(kāi)其特定的作用環(huán)境條件，常常變得不太穩(wěn)定，不適合大量生產(chǎn)的需要；酶作用的最適pH條件一般在中性，但在工業(yè)應(yīng)用中，由于底物及產(chǎn)物帶來(lái)的影響，pH值常偏離中性范圍，使酶難于發(fā)揮作用；在臨床應(yīng)用上，由于絕大多數(shù)的酶對(duì)人體而言都是外源蛋白質(zhì)，具有抗原性，直接注人會(huì)引起人體的過(guò)敏反應(yīng)。

改變酶特性有兩種主要的方法：

一是通過(guò)分子修飾的方法來(lái)改變已分離出來(lái)的天然酶的結(jié)構(gòu)；

二是通過(guò)生物工程方法改造編碼酶分子的基因，從而達(dá)到改造酶的目的。近年來(lái)應(yīng)用蛋白質(zhì)工程改造酶的一個(gè)成功例子是磷脂酶的修飾，修飾后酶變得更耐酸，現(xiàn)已廣泛地用作食品乳化劑。

酶分子是具有完整的化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)的生物大分子。酶分子的結(jié)構(gòu)決定了酶的性質(zhì)和功能。當(dāng)酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時(shí)，將會(huì)引起酶的性質(zhì)和功能的改變。

酶分子修飾是指通過(guò)對(duì)主鏈的剪接切割和側(cè)鏈的化學(xué)修飾對(duì)酶分子進(jìn)行改造。改造的目的在于改變酶的一些性質(zhì)，創(chuàng)造出天然酶不具備的某些優(yōu)良性狀，擴(kuò)大酶的應(yīng)用以達(dá)到較高的經(jīng)濟(jì)效益。同時(shí)通過(guò)酶分子修飾，研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對(duì)酶分子空間構(gòu)象的影響，可以進(jìn)一步探討其結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，所以，酶分子修飾在酶學(xué)和酶工程研究方面具有重要的意義。

Contentsofchapter５1、什么是酶分子修飾2、酶分子修飾的基本要求和條件3、酶分子的修飾方法4、酶修飾后的性質(zhì)變化GoGoGoGo5、酶的定向進(jìn)化Go５.1什么是酶分子修飾？通過(guò)各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過(guò)程稱(chēng)為酶分子修飾。即：在體外將酶分子通過(guò)人工的方法與一些化學(xué)基團(tuán)（物質(zhì)），特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。酶分子修飾的意義提高酶的活力activity增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性stability降低或消除酶的抗原性immunologicalproperty研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對(duì)酶分子空間構(gòu)象的影響structure

５.2酶分子修飾的基本要求和條件

對(duì)酶分子進(jìn)行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的選擇以及酶學(xué)性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。（1）酶的穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pH、抑制劑等。（2）酶活性中心的狀況

活性中心基團(tuán)、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等。酶分子修飾的條件修飾反應(yīng)盡可能在酶穩(wěn)定條件下進(jìn)行，并盡量不破壞酶活性功能的必需基團(tuán)，使修飾率高，同時(shí)酶的活力回收高。（1）pH與離子強(qiáng)度

pH決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。（2）修飾反應(yīng)的溫度與時(shí)間

嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間可以減少以至消除一些非專(zhuān)一性的修飾反應(yīng)。（3）反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例

５.3酶分子的修飾方法金屬離子置換修飾大分子結(jié)合修飾(共價(jià)/非共價(jià))側(cè)鏈基團(tuán)修飾肽鏈有限水解修飾氨基酸置換修飾酶分子的物理修飾(1)酶的金屬離子置換修飾把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法稱(chēng)為金屬離子置換修飾。α-淀粉酶中的鈣離子（Ca2+），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子(Zn2+)，過(guò)氧化氫酶分子中的鐵離子(Fe2+)，?；被崦阜肿又械匿\離子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子(Cu2+,Zn2+)若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會(huì)喪失其催化活性。如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復(fù)或者部分恢復(fù)。若用另一種金屬離子進(jìn)行置換，則可使酶呈現(xiàn)出不同的特性。①有的可以使酶的活性降低甚至喪失，

②有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。金屬離子置換修飾的過(guò)程

a.酶的分離純化：首先將欲進(jìn)行修飾的酶經(jīng)過(guò)分離純化，除去雜質(zhì)，獲得具有一定純度的酶液。

b.除去原有的金屬離子：在經(jīng)過(guò)純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過(guò)透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時(shí)，酶往往成為無(wú)活性狀態(tài)。c.加入置換離子：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，除去多余的置換離子，就可以得到經(jīng)過(guò)金屬離子置換后的酶。金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來(lái)含有金屬離子的酶。用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價(jià)金屬離子。(2)酶的大分子修飾非共價(jià)修飾使用一些能與酶非共價(jià)地相互作用而又能有效地保護(hù)酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它們既能通過(guò)氫鍵固定在酶分子表面，也能通過(guò)氫鍵有效地與外部水相連，從而保護(hù)酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過(guò)調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來(lái)保護(hù)酶的活力。另一類(lèi)添加物就是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子之間相互作用時(shí)，其表面區(qū)域內(nèi)排除了水分子，因而增加了相互作用力，其穩(wěn)定性也就增加了。用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過(guò)共價(jià)鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層。例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶（SOD），不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長(zhǎng)了酶在體內(nèi)的半衰期從而提高了酶藥效。每分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖酐結(jié)合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結(jié)合，酶活力達(dá)到原有酶活力的5.1倍共價(jià)修飾大分子修飾(共價(jià))的過(guò)程修飾劑的選擇：大分子結(jié)合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。要根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。修飾劑的活化：作為修飾劑中含有的基團(tuán)往往不能直接與酶分子的基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)而結(jié)合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過(guò)活化，然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。修飾：將帶有活化基團(tuán)的大分子修飾劑與經(jīng)過(guò)分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應(yīng)一段時(shí)間，使修飾劑的活化基團(tuán)與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合，對(duì)酶分子進(jìn)行修飾。分離：需要通過(guò)凝膠層析等方法進(jìn)行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開(kāi)，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。聚乙二醇是線性分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無(wú)毒性、無(wú)殘留、無(wú)免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾。酶半衰期相對(duì)穩(wěn)定性天然SOD6min1右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240

聚乙二醇-SOD

35h

350(3)酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾采用一定的方法（一般為化學(xué)法）使酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法?？梢杂糜谘芯扛鞣N基團(tuán)在酶分子中的作用及其對(duì)酶的結(jié)構(gòu)、特性和功能的影響。在研究酶的活性中心中的必需基團(tuán)時(shí)經(jīng)常采用。酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)是指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基等。這些基團(tuán)可以形成各種副鍵，對(duì)酶蛋白空間結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定有重要作用。側(cè)鏈基團(tuán)一旦改變將引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的特性和功能。催化活性/非催化活性基團(tuán)的修飾對(duì)非催化基團(tuán)修飾可改變酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，改變酶對(duì)特殊底物的束縛能力。經(jīng)常被修飾的殘基是： 親核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His 親電的Tyr、Trp對(duì)催化活性基團(tuán)可以通過(guò)選擇性修飾側(cè)鏈成分來(lái)實(shí)現(xiàn)氨基酸的取代。氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亞硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亞胺Arg胍基苯乙二醛，1,2－環(huán)己二酮、丁二酮Cys巰基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基馬來(lái)酰亞胺二硫鍵巰基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羥基碘、四硝基甲烷T(mén)rp吲哚基N-溴代琥珀酰亞胺各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑常見(jiàn)基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：羧基常見(jiàn)基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：氨基常見(jiàn)基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：巰基常見(jiàn)基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：咪唑基常見(jiàn)基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：酚羥基常見(jiàn)基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：胍基常見(jiàn)基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：色氨酸吲哚基

但解釋修飾效果須十分小心，因?yàn)椋孩偃魏我环N修飾劑不是絕對(duì)專(zhuān)一的。②有些修飾劑引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化——失活，不一定是活性中心基團(tuán)被共價(jià)修飾。③不同部分的相同基團(tuán)，修飾效果不同，分子內(nèi)部的必需基團(tuán)，不易被修飾。(4)酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾)利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶原的激活b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活氨基酸或核苷酸的置換修飾可以采用化學(xué)修飾方法，例如，Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對(duì)蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學(xué)修飾法難度大，成本高，專(zhuān)一性差，而且要對(duì)酶分子逐個(gè)進(jìn)行修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。(5)氨基酸置換修飾現(xiàn)在常用的氨基酸置換修飾的方法是定點(diǎn)突變技術(shù)。定點(diǎn)突變（sitedirectedmutagenesis）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種基因操作技術(shù)。是指在DNA序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。是蛋白質(zhì)工程（ProteinEngineering）和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術(shù)。定點(diǎn)突變技術(shù)，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進(jìn)、可靠、行之有效的手段。(6)酶分子的物理修飾通過(guò)物理修飾，可以了解不同物理?xiàng)l件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端pH值等）由于酶分子空間構(gòu)象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。特點(diǎn)在于不改變酶的組成單位及其基團(tuán)，酶分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。５.4酶修飾后的性質(zhì)變化熱穩(wěn)定性：一般來(lái)說(shuō)，熱穩(wěn)定性有較大的提高?？乖裕罕容^公認(rèn)的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。各類(lèi)失活因子的抵抗力：修飾酶對(duì)蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。半衰期：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長(zhǎng)。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強(qiáng)對(duì)熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長(zhǎng)了在體內(nèi)的半衰期。最適pH：大部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適pH發(fā)生了變化，這種變化在應(yīng)用研究上有時(shí)具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較大意義。Km的變化：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，Vm沒(méi)有明顯變化，但有些酶經(jīng)修飾后，Km值變大。５.5酶的定向進(jìn)化酶分子的合理設(shè)計(jì)(rationaldesign)酶分子的定向進(jìn)化(directedevolution)酶的合理設(shè)計(jì)體外定向進(jìn)化的意義理論上，蛋白質(zhì)分子蘊(yùn)藏著很大的進(jìn)化潛力，很多功能有待于開(kāi)發(fā)，這是酶的體外定向進(jìn)化