五羥色胺受體亞型1a在螺旋神經(jīng)元上的分布

五羥基胺是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種常見的神經(jīng)傳輸材料。五羥色胺作為神經(jīng)傳輸材料在感覺神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)傳輸形成了一個(gè)重要的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)影響各種信息機(jī)制，尤其是聽覺信息的過濾。以往的研究中顯示五羥色胺存在于哺乳動(dòng)物傳出神經(jīng)系統(tǒng)橄欖耳蝸束中,橄欖耳蝸束是連接聽覺腦干和耳蝸的傳出投射,這些傳出神經(jīng)元在耳蝸內(nèi)終止于螺旋神經(jīng)元和外毛細(xì)胞的周圍突,它主要對耳蝸內(nèi)傳導(dǎo)聽覺信息的傳入神經(jīng)的活動(dòng)起調(diào)節(jié)作用。因此研究表明螺旋神經(jīng)元可能存在五羥色胺受體,并且對螺旋神經(jīng)元進(jìn)行的聽覺傳導(dǎo)活動(dòng)起著重要的調(diào)節(jié)作用。五羥色胺受體有多種亞型,Oh等利用RT-PCR技術(shù)證實(shí)在小鼠的螺旋神經(jīng)元上存在七種五羥色胺受體亞型,分別是1A、1B、2B、2C、3、5B以及6,并且提出5羥色胺受體亞型1A可能對機(jī)械感覺信息的傳遞起著調(diào)節(jié)作用。五羥色胺受體亞型1A是目前研究得最多的五羥色胺受體亞型之一,它主要與五羥色胺結(jié)合后對組織起抑制作用。Ramboz等通過試驗(yàn)也提出五羥色胺受體亞型1A對興奮以及焦慮行為起調(diào)節(jié)作用,并認(rèn)為五羥色胺受體亞型1A的減少將導(dǎo)致焦慮的加劇。由此推測當(dāng)毛細(xì)胞刺激螺旋神經(jīng)元引起興奮時(shí),五羥色胺受體亞型1A與五羥色胺結(jié)合后對螺旋神經(jīng)元的聽覺傳導(dǎo)活動(dòng)具有重要的調(diào)節(jié)作用。因此從形態(tài)學(xué)方面顯示螺旋神經(jīng)元五羥色胺受體亞型1A的分布,對于了解它在聽覺活動(dòng)中對螺旋神經(jīng)元的作用以及作用機(jī)制具有重要的意義。而到目前為止,從形態(tài)學(xué)方面對螺旋神經(jīng)元的五羥色胺受體亞型1A的分布進(jìn)行研究還未見報(bào)道。酶標(biāo)親和素-生物素技術(shù)(labeledavidin-biotintechnique,LAB技術(shù))是利用生物素-親和素的親和作用,將酶標(biāo)親和素連接到抗原抗體復(fù)合物上,用以顯示被檢測的抗原,酶標(biāo)鏈親和素-生物素技術(shù)(labeledstreptavidin-biolintechnique,LsAB技術(shù))是以鏈親和素(streptavidin,SA)代替了親和素,具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、背景清晰等特點(diǎn)。因此本研究采用LsAB技術(shù)從形態(tài)學(xué)方面研究小鼠螺旋神經(jīng)元的五羥色胺受體亞型1A的分布情況,現(xiàn)報(bào)道如下。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出生后3~6d發(fā)育正常的乳小鼠4只,膚色正常,身體無畸形,由四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2ro鄉(xiāng)村ro鋼結(jié)構(gòu)專利劑固定液:冷丙酮溶液;一抗:五羥色胺1A受體抗體[(anti-serotonin1A(5-HT1A)-rReceptor,由SantaCruz公司提供];SP-9003試劑盒(由北京中杉金橋生物技術(shù)公司提供);顯色劑:DAB液(由Sigma公司提供)。1.3包埋、切片在解剖顯微鏡下直接將其斷頭取出雙側(cè)耳蝸,立即用冰凍切片包埋劑(OCT)將其進(jìn)行包埋,-20℃冷室切片機(jī)切片,片厚5微米,冷空氣干燥20分鐘,備用。每隔四張組織切片即作一張HE染色,以確定組織結(jié)構(gòu),中間間隔的四張組織切片中前三張劃入實(shí)驗(yàn)組,后一張劃入陰性對照組。1.4抗過血?jiǎng)┟庖叻z測細(xì)胞中的免疫指標(biāo)冷丙酮溶液固定組織10分鐘;用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗兩次,每次十分鐘,吸水紙吸去多余的液體;3%H2O2去離子水室溫孵育組織10分鐘,用以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性,PBS液沖洗并在PBS液中浸泡5分鐘;滴加封閉用正常兔血清工作液,室溫下孵育10分鐘,傾去,不洗;用移液管取適量濃度稀釋成1∶200的五羥色胺1A受體抗體滴加在組織上,置于染色盒中保持一定的濕度,放于隔水式恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),37℃作用1小時(shí),PBS液浸洗三次,每次3分鐘;滴加生物素標(biāo)記兔抗山羊IgG二抗工作液,放于隔水式恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),37℃作用15分鐘,PBS液浸洗三次,每次3分鐘;滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP),放于隔水式恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),37℃作用15分鐘,PBS液浸洗三次,每次3分鐘;滴加DAB液進(jìn)行顯色,鏡下觀察,適時(shí)用PBS液充分沖洗以終止,防止過度顯色;蘇木素對組織細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染,封片,光鏡下觀察。陰性對照組組織切片除一抗滴加PBS液取代滴加五羥色胺1A受體抗體外其余步驟同實(shí)驗(yàn)組。2模型小鼠耳蝸中螺旋神經(jīng)元的細(xì)胞形態(tài)變化HE染色的組織切片確定結(jié)構(gòu),圖示正中央胞體較大的細(xì)胞即為螺旋神經(jīng)元(圖1)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組中的4只乳小鼠耳蝸中螺旋神經(jīng)元的細(xì)胞膜均顯示明顯陽性信號,即棕色(圖2、3),而陰性對照組中的耳蝸螺旋神經(jīng)元,在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)螺旋神經(jīng)元的細(xì)胞膜未出現(xiàn)陽性信號(圖4)。表明五羥色胺1A受體存在于耳蝸螺旋神經(jīng)元的細(xì)胞膜上。3螺旋神經(jīng)元對耳蝸核的調(diào)節(jié)作用由于哺乳動(dòng)物出生以后聽覺系統(tǒng)已經(jīng)基本發(fā)育完全,同時(shí)耳蝸骨化常發(fā)生于哺乳動(dòng)物出生后極短時(shí)間內(nèi),這對耳蝸進(jìn)行冰凍切片帶來了困難,因此本研究選用出生后3~6天的乳小鼠耳蝸進(jìn)行冰凍切片,應(yīng)用LsAB技術(shù)從免疫組織化學(xué)的角度直觀地證實(shí)聽覺傳導(dǎo)通路中的第一級神經(jīng)元——螺旋神經(jīng)元的細(xì)胞膜上存在五羥色胺受體亞型1A。在實(shí)驗(yàn)中所應(yīng)用的LsAB技術(shù)充分利用了鏈霉卵白素和生物素相互結(jié)合具有較強(qiáng)特異性和親和力的特點(diǎn),并且使用3%H2O2去離子水消除了組織內(nèi)源性過氧化物酶活性以及滴加正常兔血清工作液用以封閉組織抗原,從而使組織切片經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后具有了較強(qiáng)的特異性、較清晰的背景以及較高的靈敏度。螺旋神經(jīng)元作為聽覺傳導(dǎo)通路中的第一級神經(jīng)元,位于內(nèi)耳的蝸軸中,大多數(shù)的神經(jīng)元發(fā)出周圍突到附近單個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞的底部,每個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞接受大約10個(gè)螺旋神經(jīng)元的傳入末梢。這些神經(jīng)元細(xì)胞體大,細(xì)胞突厚,有髓鞘,被稱為I型螺旋神經(jīng)元。剩下5%~10%的神經(jīng)元細(xì)胞體積小,細(xì)胞突薄,沒有髓鞘,它在柯替器隧道內(nèi)呈放射狀,形成突觸和部分外毛細(xì)胞接觸,不和內(nèi)毛細(xì)胞接觸,被稱為II型螺旋神經(jīng)元。螺旋神經(jīng)元的中樞突由耳蝸發(fā)出,經(jīng)內(nèi)聽道止于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的蝸核。因此螺旋神經(jīng)元在聽覺活動(dòng)中起著很重要的作用。五羥色胺主要在腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)合成,作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種常見神經(jīng)遞質(zhì),它是通過作用于組織器官上的五羥色胺受體影響突觸的傳遞,以達(dá)到神經(jīng)細(xì)胞興奮和抑制活動(dòng)的平衡。五羥色胺能神經(jīng)在腦內(nèi)分布廣泛,具有一定的儲(chǔ)存五羥色胺、釋放五羥色胺、與受體結(jié)合以及滅活五羥色胺的能力。在由五羥色胺形成的感覺神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,五羥色胺能神經(jīng)纖維的末梢廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的大多數(shù)聽覺核團(tuán),如耳蝸核、下丘、外側(cè)丘系核和上橄欖復(fù)合體。在耳蝸核和下丘中存在五羥色胺受體亞型1A,在初級聽覺皮層中也發(fā)現(xiàn)五羥色胺2受體和五羥色胺受體亞型1A的致密結(jié)合。離子電滲導(dǎo)入五羥色胺可促進(jìn)或抑制聽覺系統(tǒng)以外神經(jīng)元對耳蝸核神經(jīng)元的調(diào)節(jié)作用從而影響耳蝸核神經(jīng)元對聽覺信息的傳導(dǎo)。這種調(diào)控機(jī)制可能通過五羥色胺的自身調(diào)節(jié)過程來完成,如五羥色胺能縫際尾核神經(jīng)元,它們接受谷氨酸能神經(jīng)纖維的傳入信息同時(shí)又通過神經(jīng)元內(nèi)五羥色胺自身的調(diào)節(jié)作用影響信息的傳導(dǎo),這表明五羥色胺在聽覺傳導(dǎo)過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。另外有實(shí)驗(yàn)證實(shí)五羥色胺受體亞型1A是一種與G蛋白相匹配的受體亞型,它主要通過激活Giα蛋白抑制腺苷酸循環(huán)或者促進(jìn)鉀離子通道的開放從而對組織起調(diào)節(jié)作用。因此可推測在聽覺傳導(dǎo)過程中,螺旋神經(jīng)元接受毛細(xì)胞釋放的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)引起興奮時(shí),神經(jīng)傳出系統(tǒng)橄欖耳蝸束同時(shí)會(huì)釋放五羥色胺,與螺旋神經(jīng)元細(xì)胞膜上的五羥色胺受體亞型1A結(jié)合,通過激活Giα蛋白抑制腺苷酸循環(huán)或者促進(jìn)鉀離子通道的開放,從而對螺旋神經(jīng)元的興奮起重要的反饋性調(diào)節(jié)作用。谷氨酸作為非常重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)在螺旋神經(jīng)元進(jìn)行聽覺傳導(dǎo)的活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用,Nordang等證實(shí)螺旋神經(jīng)元、內(nèi)毛細(xì)胞、外毛細(xì)胞內(nèi)有谷氨酸存在,而且螺旋神經(jīng)元內(nèi)還存在谷氨酰胺合成酶和離子型NMDA受體的亞型NMDAR2。同時(shí)蔣明等也提出谷氨酸能夠使螺旋神經(jīng)元的復(fù)合動(dòng)作電位幅度提高,從而引起螺旋神經(jīng)元產(chǎn)生過度興奮,高劑量的谷氨酸還會(huì)引起螺旋神經(jīng)元發(fā)生不可逆的神經(jīng)變性。這些說明在聽覺傳導(dǎo)過程中,螺旋神經(jīng)元接受毛細(xì)胞釋放的谷氨酸產(chǎn)生興奮從而完成它對聽覺信息的傳導(dǎo)。另一方面,Vicente-Torres等發(fā)現(xiàn)在耳蝸中存在傳遞五羥色胺的物質(zhì),并進(jìn)一步說明耳蝸內(nèi)存在五羥色胺能突觸活動(dòng)。Bobbin等也認(rèn)為五羥色胺主要作用是降低豚鼠聽覺神經(jīng)的復(fù)合動(dòng)作電位。并且已有研究證實(shí)五羥色胺存在于哺乳動(dòng)物橄欖耳蝸束中,這個(gè)系統(tǒng)由兩部分組成,一部分為無髓鞘軸突,來源于外側(cè)上橄欖核小的紡錘狀神經(jīng)元(同側(cè)占主導(dǎo)),另一部分為有髓鞘軸突,來源于橄欖核周圍的大星狀神經(jīng)元,主要來源于同側(cè)的內(nèi)側(cè)上橄欖核周圍或者對側(cè)的斜方體腹側(cè)核;而且前者通過軸、樹突與I型螺旋神經(jīng)元連接,后者則與部分外毛細(xì)胞接觸。故這些也可推測在螺旋神經(jīng)元進(jìn)行聽覺信息的傳導(dǎo)過程中,通過毛細(xì)胞釋放的谷氨酸產(chǎn)生興奮從而完成聽覺信息的傳導(dǎo),同時(shí)也接受橄欖耳蝸束釋放的五羥色胺對其進(jìn)行的聽覺傳導(dǎo)活動(dòng)起反饋調(diào)節(jié)作用。但由于有實(shí)驗(yàn)指出在白噪聲(持續(xù)1h,90dBSPL)水平下五羥色胺對聽覺活動(dòng)無明顯的調(diào)節(jié)作用,因此五羥色胺在什么樣的聽覺傳導(dǎo)過程中對螺旋神經(jīng)元的興奮起調(diào)節(jié)作用需要進(jìn)一步通過其它獨(dú)特的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。因此,以上這些可推測螺旋神經(jīng)元作為聽覺通路中的第一級神經(jīng)元,當(dāng)毛細(xì)胞釋放興奮性神經(jīng)遞質(zhì)(如谷氨酸)引起螺旋神經(jīng)元興奮時(shí),中樞會(huì)通過傳出神經(jīng)系統(tǒng)橄欖耳蝸束釋放五羥色胺與螺旋神經(jīng)元細(xì)胞膜上的五羥色胺受體亞型1A結(jié)合,通過激活Giα蛋白抑制腺苷酸循環(huán),或者促進(jìn)鉀離子通道的開放對螺旋神經(jīng)元進(jìn)行的聽覺傳導(dǎo)活動(dòng)起著重要的反饋性調(diào)節(jié)作用。螺旋神經(jīng)元內(nèi)五羥色胺受體亞型1A分布情況的研究對于了解在聽