中華青胚胎低溫保存的初步研究

cyprinfo的屬于cyprinfo的范疇。這是一種小型魚類，入口引導，全長20.40毫米，身體形狀類似于透明。喜歡在上層水面游泳，易于飼養(yǎng)，分布廣泛。這是由國際組織推薦的實驗魚類胚胎發(fā)育、遺傳變化、生理特性和水生藥理的經(jīng)典模式。國外很早就將養(yǎng)殖青鳉作為水族箱內(nèi)觀賞魚來觀賞和養(yǎng)殖,經(jīng)過多年的培育出現(xiàn)了若干人工品種,根據(jù)顏色分有透明、白、銀、橙、紅、黃、金、黑、花等,體型也出現(xiàn)了幾種不同的類型,受到了人們的廣泛喜愛。青鳉卵徑大,卵膜透明,發(fā)育時間長,胚胎在器官發(fā)育完全后才會出膜,是很好的科普教學材料。我國對青鳉也有研究,1989年我國學者對東部青鳉和日本當?shù)厍圜氉霰容^研究,將青鳉分為中華青鳉和日本青鳉2個亞種,定義我國青鳉為中華青鳉(Oryziaslatipessinensis)。我國原生青鳉分布廣泛,北至黑龍江、南至海南島、西至寧夏銀川都有分布,主要生活在稻田小溪里,生物量很大。1924年為了消滅蚊子,我國從菲律賓引入了食蚊魚。食蚊魚經(jīng)過早期的適應和發(fā)展,不僅完全適應了我國的環(huán)境,而且迅速繁衍生息,將同等生態(tài)位的青鳉步步逼退,稻田里青鳉的身影越來越少,原來的“土著”青鳉也只有在未被食蚊魚入侵的少量地區(qū)生存。近些年來,隨著人們對環(huán)境的日益關注和青鳉作為觀賞魚走進家庭水族箱,青鳉的生態(tài)意義和觀賞價值得到了大家的認可。但在青鳉繁育工作中,卻遇到了繁殖量大而魚苗養(yǎng)成量小的問題。分析主要原因,一是青鳉胚胎發(fā)育時間長,28℃水溫7d才出膜,發(fā)育過程中易受水霉影響,很多胚胎因發(fā)霉而死亡;二是仔魚在繁殖季連續(xù)孵出,相互之間競爭激烈,很多剛孵出的仔魚處于劣勢,因為沒有合適的生存環(huán)境而被淘汰。低溫生物學是探索低溫(0~5℃)條件下生命現(xiàn)象的特征和規(guī)律的學科。胚胎在低溫時生命活動率低,但溫度升高到適宜溫度后,還能健康生長,低溫并沒有造成不良的影響,從而可以實現(xiàn)短期保存。魚類胚胎低溫保存在國內(nèi)外都有研究,國外研究過虹鱒、美國鱘魚胚胎的低溫保存技術,國內(nèi)對大銀魚、池沼公魚做過胚胎的低溫保存研究。本試驗采用2種常用藥孔雀石綠和聚維酮碘,還有一種常用在觀賞魚卵保存運輸?shù)哪嗵客?對青鳉胚胎低溫保存做了初步研究,擬解決青鳉在繁殖擴大規(guī)模上遇到的問題,幫助集約化養(yǎng)殖青鳉。1材料和方法1.1性飼料的制作試驗材料為中華青鳉胚胎。中華青鳉采自江蘇淮安,每200尾養(yǎng)殖在100L水體的水族箱內(nèi),水族箱內(nèi)放置生化過濾棉加氣,每天09:00、14:00、18:00共喂食3次,前2次喂食體重3%的商品細微顆粒浮性飼料,第3次喂食體重5%的新鮮鹵蟲。光-暗周期14h-10h。每天10:00吸污換水1次。青鳉06:00左右開始排卵受精,可以持續(xù)到10:00。雌魚排卵,雄魚隨后追隨授精,受精卵會成串地掛在雌魚臀鰭上,隨著雌魚運動卵塊可能被掛在濾棉上,或者2h后自由脫落。本試驗采取人工采卵,待卵受精后,用小網(wǎng)兜將雌魚撈離水面,用手或膠頭吸管將卵塊與魚體分離,然后將雌魚放回水中,卵塊收集在一處。用體式顯微鏡觀察胚胎的發(fā)育狀況,試驗之前將卵塊放于培養(yǎng)皿中水浴鍋恒溫28℃培養(yǎng)。試驗所用3個時期的胚胎分別為:發(fā)眼期胚胎(簡稱發(fā)眼期)、16肌節(jié)期胚胎(簡稱16期)、脊索空泡化完成期胚胎(簡稱脊索期)。1.2儀器OLYMPUSSZ61體式顯微鏡,雙列六孔恒溫水浴鍋(型號HWS-26),西門子冰箱(型號KK21V70)。1.3泥炭土的制備每份樣本中包括同一發(fā)育時期的胚胎15粒,保護液0.50mL,對于要添加泥炭土的樣本則加入煮沸干燥后的泥炭土20mg,一起放入60mm×40mm的自封袋中密封,在4℃冰箱中冷藏,15d后取出在28℃水浴鍋中孵化。每個試驗重復3次。結果從3個方面考察,依次為胚胎存活率、胚胎孵化率、仔魚正常率,其計算公式如下:1.4處理數(shù)據(jù)所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行方差分析,利用Excel制作圖表進行分析。2結果2.1脊索期仔魚發(fā)眼期由圖1可知,3個發(fā)育時期中,發(fā)眼期和16期保存效果較好,與脊索期差異顯著,這2個時期在0.5、1.0mg/L水平上保存效果最好。發(fā)眼期在0.5mg/L水平保存效果顯著,存活率為84.4%;16期在0.5、1.0mg/L水平上保存效果顯著高于對照和2.0mg/L水平,存活率都為82.2%,但是與同濃度的發(fā)眼期沒有顯著差異;脊索期4個水平無顯著差異。在2.0mg/L水平發(fā)眼期保存效果顯著高于16期和脊索期。發(fā)眼期、16期、脊索期的平均胚胎存活率為75.0%、71.1%、62.5%。由圖2可知,發(fā)眼期胚胎在0.5mg/L水平與對照、2.0mg/L水平組差異顯著,孵化率為84.2%;16期在0.5、1.0mg/L水平上與對照差異顯著,孵化率為75.7%、78.4%;脊索期在0.5mg/L水平與對照差異顯著,孵化率為90.3%。發(fā)眼期、16期、脊索期的平均孵化率為73.7%、73.0%、79.1%。由圖3可知,發(fā)眼期中0.5mg/L水平與對照及2.0mg/L水平差異顯著,正常率為71.11%;16期中0.5、1.0mg/L水平與對照及2.0mg/L差異顯著,正常率分別為62.2%、60.0%;脊索期中0.5、1.0mg/L水平與2.0mg/L差異顯著,正常率分別為62.2%、57.8%。在0.5、1.0mg/L水平上3個時期的仔魚正常率無顯著差異。發(fā)眼期、16期、脊索期的平均仔魚正常率分別為54.0%、48.2%、48.3%。2.2發(fā)眼期、16期仔魚的孵化、孵化由圖4可知,3個發(fā)育時期中,發(fā)眼期、16期保存效果較好,與脊索期差異顯著。在0.5mg/L水平上發(fā)眼期、16期與脊索期差異顯著,存活率分別為88.9%、86.7%。發(fā)眼期、16期、脊索期的平均胚胎存活率為86.0%、84.3%、74.5%。由圖5可知,3個時期中,發(fā)眼期的胚胎孵化率最高。發(fā)眼期中3個水平處理0.5、1.0、2.0mg/L與對照差異顯著,孵化率分別為92.5%、87.5%、76.9%;16期中0.5、1.0mg/L水平和對照差異顯著,孵化率分別為89.7%、80.0%。在0.5mg/L水平上,發(fā)眼期、16期保存效果最好,與脊索期差異顯著,孵化率分別為92.5%、89.7%。發(fā)眼期、16期、脊索期胚胎的平均孵化率為79.5%、74.0%、79.1%。由圖6可知,3個處理中發(fā)眼期仔魚正常率顯著高于脊索期。發(fā)眼期中0.5、1.0mg/L水平與對照及2.0mg/L水平差異顯著,正常率分別為82.2%、77.8%;16期中0.5、1.0mg/L水平與對照及2.0mg/L水平差異顯著,正常率為77.8%、68.9%;脊索期中0.5、1.0mg/L水平與2.0mg/L差異顯著,正常率都為64.4%。在0.5mg/L水平,發(fā)眼期、16期與脊索期差異顯著,仔魚正常率為82.2%、77.8%。發(fā)眼期、16期、脊索期的平均仔魚正常率為67.1%、59.8%、56.8%。2.3發(fā)眼期、16期、脊索期存活率由圖7可知,3個時期的胚胎存活率無顯著差異。發(fā)眼期中3個水平之間無顯著差異。16期中1.0mg/L與對照及2.0mg/L差異顯著,存活率為86.7%;脊索期在1.0mg/L與對照差異顯著,存活率為82.2%。發(fā)眼期、16期、脊索期的平均存活率為74.5%、68.3%、72.7%。由圖8可知,16期中2.0mg/L水平孵化率最高,為87.9%。發(fā)眼期、16期、脊索期的平均孵化率為73.3%、73.8%、66.2%。由圖9可知,發(fā)眼期中1.0mg/L與對照及4.0mg/L水平差異顯著,正常率為71.1%;16期中1.0mg/L水平與對照及4.0mg/L差異顯著,正常率為60.0%。發(fā)眼期、16期、脊索期的平均仔魚正常率為51.6%、45.5%、45.0%。2.4脊索期仔魚的生殖情況由圖10可知,3個時期的胚胎存活率無顯著差異,發(fā)眼期、16期、脊索期的平均胚胎存活率為84.3%、79.0%、80.5%。由圖11可知,發(fā)眼期、16期與脊索期胚胎孵化率差異顯著。發(fā)眼期中1.0、2.0mg/L與對照及4.0mg/L水平差異顯著,孵化率為87.5%、82.5%;16期中3個處理組與對照差異顯著,孵化率分別為82.1%、94.3%、84.4%。脊索期中1.0、2.0mg/L與4.0mg/L處理水平差異顯著,孵化率分別為71.8%、78.4%。在4.0mg/L水平時,發(fā)眼期、16期與脊索期有顯著差異。發(fā)眼期、16期、脊索期的平均胚胎孵化率為74.5%、78.1%、69.3%。由圖12可知,3個時期的仔魚正常率無顯著差異。發(fā)眼期中1.0、2.0mg/L水平與對照及4.0mg/L差異顯著,正常率分別為77.8%、71.1%;16期中1.0、2.0mg/L水平與對照及4.0mg/L差異顯著,正常率分別為71.1%、68.9%。脊索期中對照、1.0、2.0mg/L處理與4.0mg/L處理差異顯著,正常率分別為53.3%、62.2%、60.0%。發(fā)眼期、16期、脊索期的平均仔魚正常率為61.2%、57.7%、52.7%。3青胚胎在低溫保存和保護中的作用本試驗中,中華青鳉胚胎經(jīng)過15d的低溫保存,平均存活率為76.2%,之后又順利孵化成仔魚,可見低溫保存青鳉胚胎是可行的。國內(nèi)外已有大量關于水溫對魚類胚胎發(fā)育的影響的研究資料,主要集中在胚胎發(fā)育的有效溫度、最適溫度、臨界溫度以及積溫等方面,關于低溫對于魚類胚胎的影響方面研究不多。國內(nèi)做過大銀魚、池沼公魚的胚胎低溫保存和短途運輸技術研究,但這2種魚的胚胎能夠在低溫下保存和發(fā)育。青鳉的最低產(chǎn)卵溫度范圍為21~28℃,遠高于低溫范圍(0~4℃),在這種情況下關于低溫保存胚胎的研究還沒有報道過。本試驗中,低溫保存時青鳉胚胎經(jīng)常受到水霉菌的污染,這是胚胎死亡的主要原因。水霉菌適應溫度范圍廣,分布范圍也大,一旦發(fā)生將難以控制,往往給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。如何控制水霉是低溫保存魚類胚胎首要解決的問題,常用方法有添加食鹽、孔雀石綠、高錳酸鉀、甲醛等,近些年也有關于中草藥和微生態(tài)制劑用于防治水霉病的研究。本試驗在采用了孔雀石綠、聚維酮碘2種藥品的基礎上,添加了泥炭土來防治水霉病。泥炭土是分解不充分的植物殘體積累而形成的土壤,經(jīng)常用于鳉科魚其他種屬的運輸保存,效果很好。本試驗觀察到泥炭土阻礙了水霉菌絲的擴散,有效抑制了水霉。本試驗選取了3個不同發(fā)育時期發(fā)眼期、16肌節(jié)期、脊索空泡化完成期的胚胎進行低溫保存,結果發(fā)現(xiàn),發(fā)眼期胚胎的存活率、孵化率和仔魚正常率都較高,比其他2個時期保存效果好。在超低溫冷凍保存魚類胚胎的研究中,發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育時期的胚胎對抗凍劑的抗性不同,在對青鳉胚胎的超低溫保存中發(fā)現(xiàn)保護劑的毒性在發(fā)眼期最弱。本試驗對青鳉胚胎低溫保護液設置了不同的濃度,結果表明高濃度的保護液(聚維酮碘2.0mg/L、孔雀石綠4.0mg/L)對青鳉胚胎有傷害作用,這