植物組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象與成因

植物組織培養(yǎng)對植物遠(yuǎn)離身體的快速繁殖、無病毒苗的培育、遺傳育種和胚質(zhì)資源的保存有所增加。但是,在植物的組織培養(yǎng)中易出現(xiàn)外植體或培養(yǎng)物的褐化現(xiàn)象。褐化現(xiàn)象與菌類污染和玻璃化并稱植物組織培養(yǎng)的3大難題。1細(xì)胞表型的結(jié)構(gòu)就其活性而產(chǎn)生的功能褐化是指在植物組織培養(yǎng)過程中,外植體在誘導(dǎo)脫分化或再分化時(shí),自身組織由其表面向培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì),以致培養(yǎng)基逐漸變成褐色,外植體也隨之進(jìn)一步變褐而死亡的現(xiàn)象。褐化一般分為兩種形式:(1)由于細(xì)胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細(xì)胞死亡(稱為壞死)而形成的褐化現(xiàn)象,不涉及酚類物質(zhì)的產(chǎn)生。諸多不利條件(如溫度)都可以造成細(xì)胞的程序化死亡。(2)因?yàn)榉宇愇镔|(zhì)被多酚氧化酶(PPO)氧化所引起。在完整的組織和細(xì)胞中,酚類物質(zhì)和PPO是分隔存在的———酚類物質(zhì)分布在液泡中,而PPO則分布在各種質(zhì)體或細(xì)胞質(zhì)中,這種區(qū)域性分布使底物與PPO不接觸。但當(dāng)外植體組織被切割和接種時(shí),細(xì)胞膜被破壞,從而破壞了酚類化合物和多酚氧化酶的分隔狀態(tài),使兩者相遇,酚類化合物在酶的催化下迅速氧化而形成褐色醌類物質(zhì),并進(jìn)一步與組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合,抑制其他酶的活性,毒害整個(gè)外植體組織,導(dǎo)致組織代謝紊亂,生長受阻,最終逐漸死亡。以棉花為例,對陸地棉正常愈傷組織與褐化愈傷組織研究發(fā)現(xiàn),褐化愈傷組織的PPO活性、棉酚含量均高于正常的愈傷組織,而超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性和可溶性糖的含量均低于正常的愈傷組織。這是由于細(xì)胞膜遭到破壞使PPO與棉酚在有氧條件下結(jié)合生成醌類物質(zhì),導(dǎo)致愈傷組織的褐化。而愈傷組織的褐化促使SOD、CAT活性下降和可溶性糖含量降低。2影響棕櫚樹的因素2.1木本植物無性系褐化的程度由于各種植物中單寧等酚類化合物的數(shù)量和多酚氧化酶的活性不同,因此不同種植物發(fā)生褐化的頻率和嚴(yán)重程度不同。一般木本植物的酚類化合物含量比草本植物高,因此進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí),木本植物更容易發(fā)生褐化。同種植物的不同類型、不同品種發(fā)生褐化的情況也不同。如對桉樹的研究發(fā)現(xiàn),柳桉的莖段比較容易褐化,雜交桉U6的莖段褐化程度比較輕;鄧恩桉25、13號無性系褐化程度較輕,24號無性系褐化較重。王宏偉等發(fā)現(xiàn)沈農(nóng)糯玉米和白糯1號褐化率較低。2.2外植體情況2.2.1外植體的生理狀況一般來說,褐化隨材料的年齡和組織木質(zhì)化的程度而增加。外植體的老化程度越高,其木質(zhì)素的含量也越高,也越易產(chǎn)生褐化,成齡材料一般均比幼齡材料褐化嚴(yán)重。邱路等報(bào)道,用桑樹基部發(fā)出的幼芽作外植體比用桑樹上部高大枝條上的壯芽做外植體褐化輕,褐化率低;幼齡樹比老齡樹褐化輕,褐化率低;阿月渾子2年生和4年生材料組織培養(yǎng)易獲得成功,但8年生和26年生材料則出現(xiàn)褐變現(xiàn)象。在對早脆王品種棗的胚離體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),完整接種的早脆王胚珠隨其成熟度的增加褐化加重。外植體大小對褐化的影響,表現(xiàn)為小的材料更容易發(fā)生褐化,相對較大的材料則褐化的程度較輕。另外切口越大,酚類物質(zhì)的被氧化面也越大,褐化程度就會更嚴(yán)重。蔣迪軍等報(bào)道,金冠蘋果莖尖小于0.5mm時(shí)褐變嚴(yán)重,當(dāng)莖尖長度在5~15mm時(shí)褐變程度較輕。2.2.2不同種類植物生長的植物可以提高干預(yù)發(fā)酵由于植物體內(nèi)酚類化合物含量和多酚氧化酶的活性在不同的生長季節(jié)并不相同,一般在生長季節(jié)含有較多的酚類化合物。因此,一般來說冬季褐變少,夏秋季褐變最嚴(yán)重,接種后存活率也最低。如卡德蘭在新莖旺盛生長的6~9月間褐變物顯著增加,在生長較弱的冬春季顯著減少。核桃、歐洲栗、海棗、牡丹也有類似情況。在取材部位上存在幼嫩莖尖較其他部位褐化程度低的現(xiàn)象,木質(zhì)化程度高的節(jié)段在進(jìn)行藥劑消毒處理后褐化現(xiàn)象更嚴(yán)重。Yu等對葡萄的研究發(fā)現(xiàn),從側(cè)生蔓枝切取的莖尖比延長蔓切取的酚類物質(zhì)含量低,更易存活。劉蘭英在“薄殼香”核桃的組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)隨著芽位的降低,褐變率顯著提高。張明麗等在對金葉紅瑞木的研究中發(fā)現(xiàn),影響褐化的主要因素是枝芽的著生位置。2.2.3精消毒的效果接種時(shí)各種化學(xué)消毒劑對外植體的傷害也會引起褐化。消毒劑不同,消毒時(shí)間不同,外植體的褐化程度也不同。酒精消毒雖然效果較好,但易對材料造成傷害,導(dǎo)致褐化,升汞對外植體傷害比較輕。且消毒時(shí)間越長,消毒效果越好,但褐變越嚴(yán)重。在消毒時(shí)間方面,一般是消毒時(shí)間越長,褐化率越高,因而消毒時(shí)間應(yīng)掌握在一定范圍內(nèi)才能保證較高的外植體成活率。肖顯華等人通過對蘋果枝條的研究發(fā)現(xiàn)消毒后用磁力攪動充分清洗材料對減輕褐化是有效的。2.3培訓(xùn)條件2.3.1植物的不同培養(yǎng)由于光能促進(jìn)多種植物組培中酚的氧化,因此在采集外植體之前,如果將取材母株進(jìn)行遮光處理,然后再切取外植體,能夠有效地抑制褐化的發(fā)生。初代培養(yǎng)時(shí),將接種的材料在黑暗條件下培養(yǎng),對抑制褐化發(fā)生也有一定效果。在對巨桉葉片的研究中發(fā)現(xiàn)光照條件對巨按葉片滲出物形成的影響從低到高依次為:黑暗、漫射光、短日照、長日照。在魔芋組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化在黑暗或散射光下培養(yǎng),可大大減少切塊傷口褐化程度。2.3.2卡特蘭褐化的培養(yǎng)溫度對褐化影響很大:高溫能使PPO的活性提高,促進(jìn)酚類氧化;而低溫可以抑制酚類化合物的合成,降低多酚氧化酶活性,減少酚類氧化,從而減輕褐化。Ishii等發(fā)現(xiàn)卡特蘭在15~25℃培養(yǎng)比在25℃以上褐化輕。核桃組培中發(fā)現(xiàn),(25±2)℃條件下褐變率為52.75%,而在(18±2)℃條件下褐變率為29.8%。在桉樹的組織培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象:把接好的不同桉樹品種外植體分別培養(yǎng)在高溫(23~27℃)和低溫(16~20℃)條件下得出,高溫培養(yǎng)可明顯促使褐化的發(fā)生,褐化率達(dá)52.17%,而低溫條件下褐化率僅為29.18%。2.4培養(yǎng)基2.4.1降低無機(jī)鹽濃度過高無機(jī)鹽濃度會引起某些植物外植體中酚類物質(zhì)氧化。在桑樹組培中,1/2MS培養(yǎng)基,降低無機(jī)鹽濃度能減輕褐化現(xiàn)象,降低褐化率。油棕用MS培養(yǎng)基容易引起外植體的褐變,而用降低了無機(jī)鹽濃度的改良MS培養(yǎng)基時(shí)則可減輕褐變,并可誘導(dǎo)出愈傷組織和胚狀體。劉蘭英發(fā)現(xiàn),將DKW培養(yǎng)基的無機(jī)鹽濃度減少1/2,核桃外植體的褐變率由55.8%降至32.5%。2.4.2合部位產(chǎn)生的影響pH值可能對酚類物質(zhì)和酚氧化酶結(jié)合部位產(chǎn)生影響。在卡特蘭中發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基pH值4.0~5.0時(shí)外植體褐化物多,pH值為5.5時(shí)則少。2.4.3培養(yǎng)基中kt和ba對褐變的影響生長調(diào)節(jié)物質(zhì)使用不當(dāng),培養(yǎng)材料容易褐化,細(xì)胞分裂素具有刺激多酚氧化酶活性提高的作用,在核桃的組培中,培養(yǎng)基中BA和KT的含量為3.0~6.0mg/L時(shí)能顯著促進(jìn)褐變的發(fā)生。當(dāng)BA為10mg/L時(shí),褐變率為35.4%;為30和60mg/L時(shí),褐變率分別是54.4%和72.3%。而當(dāng)培養(yǎng)基中KT的含量為3.0和6.0mg/L時(shí),褐變率分別是60.3%和70.6%,與前者差異顯著,而且均高于對照。在桑樹的組培中BA的使用濃度低,褐化輕,褐化率低,隨BA濃度的提高,褐化重,褐化率高。2.4.4不同培養(yǎng)基間的誘導(dǎo)分離液體培養(yǎng)基中外植體溢出的毒害物質(zhì)可以很快擴(kuò)散,相對而言對外植體傷害較輕。把核桃分別在固體、半固體和液體培養(yǎng)基上培養(yǎng),結(jié)果半固體培養(yǎng)基芽的誘導(dǎo)成功,而其他培養(yǎng)基上都發(fā)生了氧化褐變。鳳梨外植體用液體培養(yǎng)可解決褐變。在桑樹組織培養(yǎng)中隨瓊脂用量的減少,培養(yǎng)基硬度減小,褐化重,褐化率高。3控制棕櫚樹的措施3.1植物外施酚類物質(zhì)通常外植體應(yīng)具有較強(qiáng)的分生能力,在最適宜的細(xì)胞脫分化和再分化培養(yǎng)條件下,使外植體處于旺盛的生長狀態(tài),可大大減輕褐變。因此多選擇幼齡植株取材。在植株的一定部位取材,使材料中酚類物質(zhì)含量較低,也有助于減少褐化。在對早脆王品種的胚離體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)取出其胚珠,剝?nèi)ブ楸唤臃N可有效防止褐化。3.2母株和外植體的預(yù)處理3.2.1培養(yǎng)期間不同光照對褐化率的影響對母株進(jìn)行遮光處理,可以減輕褐化程度,有利于初代培養(yǎng)物的萌發(fā)。在月季的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),相同的外植體在初代培養(yǎng)結(jié)束時(shí),重度遮光處理下褐化的百分比最低為58.2%,而自然光照和輕度遮光處理的褐化率分別為88.3%和79.6%。歐陽磊等在桉樹培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),在采集穗條的前幾天,用黑色塑料袋將枝條套住,減少光線的照射,可以有效降低外植體誘導(dǎo)的褐化率,鄧恩桉離體芽誘導(dǎo)對比試驗(yàn),褐化率減少了22.18%。3.2.2溫預(yù)處理低溫處理有助于減輕褐化。核桃、蘋果外植體在5℃下進(jìn)行低溫預(yù)處理一段時(shí)間有助于減輕褐化。紅豆杉采用45℃預(yù)處理對克服褐化有效,但組織的活力有較大損傷影響愈傷組織的發(fā)生。巨桉帶芽莖段在5℃低溫下處理幾天后褐化率有所減少。3.2.3液體培養(yǎng)基培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)有助于避免酚類物質(zhì)的毒害。如在20年生的檸檬母本植株上采集莖芽,需先在液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d,然后在半固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。核桃外植體需預(yù)先在只含有蔗糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5~7d;板栗最初2~3d用一定濃度的咖啡堿或含有石灰的培養(yǎng)基使形成層的傷口的單寧沉淀有助于減輕褐化。3.3選擇合適的培養(yǎng)基3.3.1養(yǎng)基預(yù)防效果有報(bào)道,鄧恩桉誘導(dǎo)培養(yǎng)在經(jīng)過改良的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)比在未經(jīng)改良培養(yǎng)基中效果好,褐化死亡率有所降低。油棕用改良的MS培養(yǎng)基,蘋果用1/2MS的培養(yǎng)基也可減輕褐化。3.3.2外源激素研究發(fā)現(xiàn),高濃度的細(xì)胞分裂素和生長素有可能刺激桉樹外植體的氧化,巨桉和鄧恩桉帶芽莖段在高濃度的外源激素中進(jìn)行誘導(dǎo)褐化率較高,而在低濃度的外源激素中誘導(dǎo)褐化率減少。3.3.3抗壞血酸對愈傷組織褐化的影響包括抗壞血酸(VitC)、硫代硫酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮(pyrrolidone,PVP)、血清白蛋白、檸檬酸等。在紅豆杉培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)基添加0.01~0.2mg/L抗壞血酸能較為有效抑制愈傷組織褐化。華蓋木組織培養(yǎng)中,PVP、二硫蘇糖醇(DTT)、抗壞血酸3種防褐化劑對褐化的抑制作用較為明顯,其效果PVP>DTF>Vc。3.3.4活性炭對酚類氧化物的吸附活性炭是一種吸附性較強(qiáng)的吸附劑,但應(yīng)盡量使用最小濃度的活性炭。有報(bào)道,0.1%~0.5%活性炭對吸附酚類氧化物的效果很明顯。但活性炭的吸附作用沒有選擇性,在吸附酚類氧化物的同時(shí)也吸附營養(yǎng)物質(zhì)。蝴蝶蘭的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),活性炭能有效控制褐化和促進(jìn)生長,但不利于分化。PVP也是常用的吸附劑含PVP培養(yǎng)基的“抗褐”能力明顯強(qiáng)于含活性炭的培養(yǎng)基。3.4添加新鮮的培養(yǎng)液對番茄原生質(zhì)體釋放類物質(zhì)的影響加快繼代轉(zhuǎn)瓶的速度,及時(shí)更換新鮮