連錢(qián)草萃取物的制備及其抑菌活性研究

隨著社會(huì)主義現(xiàn)代化的推進(jìn)，社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平不斷提高，人們對(duì)環(huán)境素質(zhì)的要求也越來(lái)越高。植物起源和農(nóng)藥的研究吸引了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。近20年,我國(guó)植物源農(nóng)藥的研制相當(dāng)活躍,已生產(chǎn)和實(shí)際應(yīng)用了40多種植物源殺蟲(chóng)劑,100多家植物源農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)。植物是生物活性化合物的天然寶庫(kù),其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物超過(guò)40萬(wàn)種。研究表明,萬(wàn)壽菊、丁香、地膚子、蒼耳、土木香等對(duì)植物病原菌均有一定的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)室研究表明,鴉膽子對(duì)甜菜夜蛾有較強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性,并首次在鴉膽子中分離鑒定了2個(gè)具有殺蟲(chóng)活性的化合物。因此,對(duì)這些有生物活性的植物進(jìn)行研究,不僅可以為植物源農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù),還可以發(fā)現(xiàn)新的先導(dǎo)化合物,進(jìn)行模擬合成,開(kāi)發(fā)新型農(nóng)藥。連錢(qián)草(Glechomalongituba(Nakai)Kupr.)別名活血丹、金錢(qián)草、遍地香。為唇形花科,活血丹屬。除西北、內(nèi)蒙古外,全國(guó)各地均產(chǎn)。有研究表明,連錢(qián)草對(duì)金黃色葡萄球菌極度敏感,對(duì)痢疾桿菌、綠膿桿菌、傷寒桿菌中度敏感。楊念云等從連錢(qián)草全草中分離并鑒定了10個(gè)黃酮類(lèi)化合物。本文以蘋(píng)果腐爛病菌(ValsamaliMiyabeetYamada.)、棉花立枯病菌(ThanatepephoruscucumerisDonk.)、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporiumf.cucumerinum)和番茄灰霉病菌(BotrytiscinereaPers.)為指示菌,測(cè)定了連錢(qián)草萃取物的生物活性,為其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1試驗(yàn)植物材料1.2黃瓜衰落病原菌numoxsporuscucunum蘋(píng)果腐爛病菌(ValsamaliMiyabeetYama-da.)棉花立枯病菌(ThanatepephoruscucumerisDonk.)黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporiumf.cucu-merinum)番茄灰霉病菌(BotrytiscinereaPers.)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所農(nóng)藥毒理及天然產(chǎn)物化學(xué)研究組提供。1.3測(cè)試方法1.3.1包括千草乙醇提取、制備1.3.2毒力的回歸方程菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照菌落的直徑-處理菌落的直徑)/對(duì)照菌落的直徑×100式中菌落直徑(cm)=測(cè)量菌落直徑平均值-0.4利用DPS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)算毒力回歸方程及EC50。2結(jié)果與分析2.1不同萃取物對(duì)植物a表1結(jié)果表明:連錢(qián)草萃取物對(duì)4種植物病原真菌均有一定的抑制活性,其中氯仿萃取物對(duì)棉花立枯病菌的抑制作用最強(qiáng),EC50為0.6193mg/mL。其次是番茄灰霉病菌和黃瓜枯萎病菌,EC50分別為1.5563mg/mL和1.6898mg/mL。而極性較小的石油醚萃取物、氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物對(duì)4種植物病原真菌的抑制活性均較強(qiáng),其中石油醚萃取物對(duì)4種植物病原真菌的EC50分別為:0.8373、3.5178、1.4960、2.3517mg/mL,氯仿萃取物對(duì)4種植物病原真菌的EC50分別為:0.6193、4.4586、1.6898、1.5563mg/mL。表2結(jié)果表明:對(duì)于棉花立枯病菌和番茄灰霉病菌,氯仿萃取物的抑制活性最強(qiáng),EC50分別為0.6193mg/mL和1.5563mg/mL,其次是乙酸乙酯萃取物、石油醚萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物。而對(duì)于蘋(píng)果腐爛病菌和黃瓜枯萎病菌,石油醚萃取物的抑制活性最強(qiáng),EC50分別為3.5178mg/mL和1.4960mg/mL。綜合來(lái)看,連錢(qián)草萃取物中極性較小的石油醚萃取物、氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物對(duì)4種植物病原真菌的抑制活性較強(qiáng),根據(jù)相似相溶原理可知,連錢(qián)草中對(duì)4種植物病原真菌的生長(zhǎng)起抑制作用成分的極性較小,因此有必要對(duì)連錢(qián)草中極性較小的萃取物進(jìn)行進(jìn)一步的分離。表1連錢(qián)草萃取物對(duì)4種植物病原真菌抑制活性的測(cè)定結(jié)果表2連錢(qián)草萃取物對(duì)4種植物病原真菌抑制活性大小比較結(jié)果3連錢(qián)草萃取物的抑制作用連錢(qián)草萃取物對(duì)4種植物病原真菌均有一定的抑制活性,且極性較小的石油醚萃取物、氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物對(duì)4種植物病原真菌的抑制活性較強(qiáng),根據(jù)相似相溶原理可知,連錢(qián)草中對(duì)4種植物病原真菌的生長(zhǎng)起抑制作用成分的極性較小,因此有必要對(duì)連錢(qián)草中極性較小的萃取物進(jìn)行進(jìn)一步的分離,確定其活性成分,為連錢(qián)草的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。而開(kāi)展連錢(qián)草抑菌活性成分的研究,對(duì)發(fā)現(xiàn)高效、低毒、作用位點(diǎn)單一的農(nóng)藥先導(dǎo)化合物也具有積極意義。從對(duì)植物病原真菌的抑制作用來(lái)看,連錢(qián)草萃取物對(duì)棉花立枯病菌的抑制作用最強(qiáng),其次是黃瓜枯萎病菌和番茄灰霉病菌。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果的調(diào)查中發(fā)現(xiàn),連錢(qián)草萃取物處理的蘋(píng)果腐爛病菌的菌落不同于多菌靈處理的蘋(píng)果腐爛病菌的菌落,推想連錢(qián)草萃取物對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌的抑制作用機(jī)理可能與多菌靈對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌的抑制作用機(jī)理不同,而兩者的抑制作用機(jī)理是否真正不同,還需要進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。連錢(qián)草(Glechomalongituba(Nakai)Kupr.)全株,購(gòu)于河北省安國(guó)市新華中藥材有限責(zé)任公司。采用超聲波提取法:將連錢(qián)草經(jīng)DGF2100型植物粉碎機(jī)粉碎,過(guò)40目篩,稱(chēng)取3kg干粉,按料液比為1:6的比例,依次加入95%、80%、70%的乙醇,每次均在40℃,80Hz的條件下超聲30min,之后靜置24h,抽濾得濾液,將3次的濾液合并,用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)濃縮至膏狀,收集于棕色瓶中,置4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用液液分配萃取?將連錢(qián)草乙醇提取物加入4倍量的水溶解。依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行連續(xù)等量的萃取,減壓濃縮萃取液,分別得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物的浸膏,分別稱(chēng)重后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.3.3生長(zhǎng)抑制率測(cè)定參照陳年春的生長(zhǎng)速率測(cè)定法:將各萃取物用6%的DMSO分別配成5、2.5、1.25、0.625、0.3125g/L5個(gè)濃度梯度,以培養(yǎng)皿中加入等量蒸餾水作為空白對(duì)照,以加入等量6%的DMSO作為溶劑對(duì)照,并設(shè)多菌靈(石家莊金田化工有限公司、80%WPCarbendazim)為陽(yáng)性對(duì)照,在培養(yǎng)皿中加入帶藥培養(yǎng)基,待培養(yǎng)基凝固后,用滅過(guò)菌的內(nèi)徑為4mm打孔器在培養(yǎng)好的病原菌上打孔取樣,得到直徑為4mm的菌餅,放入帶藥培養(yǎng)基的中央,每皿一個(gè)菌餅,