甜瓜枯萎病防治藥劑篩選試驗

據聯合國糧農組織統(tǒng)計，南瓜總量是所有水果的第十名，增長是所有水果的第二位。中國的甜美產量在所有國家是第一位。然而，由于干旱，祖母采取了許多措施來提高杏仁產量。而目前防治甜瓜枯萎病的主要方法還是化學防治,由于長期用藥,使甜瓜枯萎病病原菌產生抗藥性,最終導致防治效果不理想,再加上化學藥劑的大量使用對甜瓜質量安全與環(huán)境造成許多負面影響,因此尋求綠色無公害的生物防治是甜瓜產業(yè)發(fā)展過程中的一項重要課題。自1998年哈密瓜在海南試種以來,哈密瓜在海南的種植面積不斷擴大,2008年哈密瓜種植面積就已經達到了0.37萬hm2。同年在海南三亞發(fā)現了甜瓜枯萎病,并最終確定是由甜瓜枯萎病病菌引起,但海南至今還沒有關于甜瓜枯萎病生防菌的報道。本研究通過從海南土壤中篩選拮抗菌防治甜瓜枯萎病,以期為熱帶地區(qū)甜瓜枯萎病的生物防治提供科學依據,同時豐富甜瓜枯萎病的生防資源,促進生物防治技術的發(fā)展。1材料和方法1.1土壤樣品采集甜瓜枯萎病病原菌FJAT-9062(Fusariumoxysporum),來源于福建省農業(yè)科學院農業(yè)生物資源研究所農業(yè)微生物研究中心;甜瓜種子南海蜜,由新疆寶豐種業(yè)有限公司和三亞市南繁科學技術研究院聯合選育;土壤樣品采集于海南省三亞、陵水、保亭、樂東、五指山、儋州、白沙、臨高、澄邁、文昌、瓊海等11市縣;參照《微生物實驗手冊》配制PDA、PDB、改良馬丁培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。1.2測試方法1.2.1菌種的活化處理稱取10.0g土壤樣品于裝有90.0mL滅菌水和幾粒沸石的250mL錐形瓶中,將錐形瓶放于振蕩器上,以200r/min振蕩30min;然后按10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍系列稀釋后,分別吸取100μL菌懸液均勻涂布于不同培養(yǎng)基的分離平板上,每個處理3次重復。將涂布好的平板置于28℃下恒溫培養(yǎng),待菌落長出后,對其進行多次劃線分離純化培養(yǎng),直至得到純菌株。1.2.3培養(yǎng)抗菌劑(1)平板對峙實驗(同步拮抗實驗):以甜瓜枯萎病菌為指示菌,將初篩得到產生抑菌帶的菌株,用打孔器打取5mm菌餅接種于距離病原菌中心2cm的四周,同一平板上只接一種初篩菌;培養(yǎng)4d后測抑菌圈半徑、拮抗菌半徑,計算拮抗指數。抑菌圈半徑=拮抗菌菌餅中心至甜瓜枯萎病病菌菌絲邊緣的距離拮抗指數=(抑菌圈半徑-拮抗菌半徑)/拮抗菌半徑(2)繼代培養(yǎng)實驗:將平板對峙實驗中篩選的拮抗效果較好的菌種進行繼代培養(yǎng),逐代進行平板對峙實驗,觀測其拮抗指數的變化,從而確定菌種的遺傳穩(wěn)定性。(3)發(fā)芽率實驗:將平板對峙實驗中篩選的拮抗指數較好的菌株轉接至PDB培養(yǎng)基中搖床振蕩培養(yǎng)24h,即得拮抗菌菌懸液;挑取飽滿的南海蜜甜瓜種子,用10%H2O2對甜瓜種子進行表面消毒5min后用無菌水清洗3～4次,再將種子浸泡于拮抗菌菌懸液中2h,同時以未加入拮抗菌的PDB作對照,每處理30粒甜瓜種子,3次重復;浸泡完畢后,將甜瓜種子置于滅菌培養(yǎng)皿中的濕潤無菌濾紙上,種子上加蓋一層濕紗布,30℃催芽36h,統(tǒng)計種子的發(fā)芽率。1.2.4甜瓜枯渙病的防治將甜瓜枯萎病病原菌搖床培養(yǎng)之后,制成107CFU/mL的孢子懸浮液,拮抗菌選擇拮抗效果較好的菌株D1、F1、H3做盆栽實驗,分別將拮抗菌培養(yǎng)好后,制成106、107、108CFU/mL3個濃度的菌懸液,在甜瓜苗緩苗后進行接菌處理。所做的處理有先接病原菌,再接不同濃度的上述拮抗菌(以D1為例,拮抗菌液由低至高濃度,分別記為D1-1、D1-2、D1-3)和先分別接不同濃度的拮抗菌,再接入病原菌(分別記為D1-4、D1-5、D1-6),以只接入病原菌為對照,每種菌的接菌量均為10mL,每個重復10盆,每盆1株甜瓜苗。接菌之后每天觀察植株發(fā)病情況,計算病情指數和相對防治效果。甜瓜枯萎病發(fā)病分級標準:0級,全株無病;1級,植株1/4以下葉面表現萎蔫癥狀;2級,植株1/4～1/2葉面表現萎蔫癥狀;3級,植株1/2以上葉面表現萎蔫癥狀;4級,全株萎蔫死亡。1.2.5微生物的測定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》、《伯杰細菌鑒定手冊》及《分子克隆實驗指南》的方法對拮抗菌F1的菌體形態(tài)、生理生化指標進行測定及16SrDNA測序。2結果與分析2.1對菌株的分離和提取從所采集的土壤樣品中分離純化得到570株菌。2.2抗感染的初始篩選通過對分離純化的菌株進行平板對峙實驗,篩選到43株對甜瓜枯萎病病原菌FJAT-9062有抑制效果的菌株。2.3抗感染復過濾2.3.1抗性能測定各越好的比較拮抗指數作為拮抗菌對病原菌拮抗效果的一種表示方式,當拮抗指數越大時,拮抗菌對病原菌的拮抗效果也就越好;反之,則拮抗效果越差。將初篩中得到的43株菌復篩,由表1可知,拮抗指數>2的菌株有9株,拮抗指數>1的菌株有11株;拮抗指數>0.5的菌株共12株,拮抗效果由好到差依次為D3、H5、H3、D1、H6、H20、F1、H7、H2、H18、H19、H21。2.3.2株病原菌fat-9062的抗性特征對2.3.1中拮抗指數>0.5的12株菌通過繼代培養(yǎng),觀察其子代對病原菌FJAT-9062的拮抗效果。由圖1可知,在第20代時只有5株菌對病原菌FJAT-9062還有拮抗效果,它們分別是D1、F1、H3、H5、H6。說明菌株D1、F1、H3、H5、H6對病原菌FJAT-9062的拮抗效果持久有效,有利于拮抗菌在較長時間內對病原菌起到抑制作用。2.3.3不同菌株對甜瓜種子發(fā)芽率的影響對2.3.1中拮抗指數>0.5的12株菌進行甜瓜種子發(fā)芽率實驗,結果見圖2。菌株處理D1、F1、H3、CK之間差異不顯著,發(fā)芽率分別為86.7%、92.2%、94.4%、90.0%,其他菌株處理的甜瓜種子發(fā)芽率極顯著低于CK;說明D1、F1、H3菌株對甜瓜種子發(fā)芽率無不良影響。綜合平板對峙、繼代培養(yǎng)、發(fā)芽率3個實驗的結果,可知拮抗菌D1、F1、H3在對病原菌拮抗效果、遺傳穩(wěn)定性及對甜瓜種子發(fā)芽率上比其他拮抗菌好,因此選擇拮抗菌D1、F1、H3作為盆栽試驗菌。2.4接種病原菌對甜瓜病情指數的影響由圖3可知,只加病原菌FJAT-9062的處理,甜瓜植株的病情指數為85.0,發(fā)病最嚴重,F1-6處理的甜瓜植株病情指數為25.0,病情指數最低發(fā)病最輕;在其他條件相同下,經F1菌株處理的甜瓜病情指數明顯小于D1、H3處理;病情指數D1-4<D1-1、D1-5<D1-2、D1-6<D1-3、F1-4<F1-1、F1-5<F1-2、F1-6<F1-3、H3-4<H3-1、H3-5<H3-2、H3-6<H3-3,說明先接拮抗菌后接病原菌處理的甜瓜病情指數要小于先接病原菌后接拮抗菌,進一步說明在一定程度上拮抗菌對甜瓜枯萎病的發(fā)生有一定的預防作用;病情指數D1-3<D1-2<D1-1、D1-6<D1-5<D1-4、F1-3=F1-2<F1-1、F1-6<F1-5<F1-4、H3-3<H3-2<H3-1、H3-6=H3-5<H3-4,說明高濃度拮抗菌處理的病情指數一般要小于低濃度處理;在整體效果上,經F1菌株處理的甜瓜病情指數要明顯小于D1、H3、FJAT-9062的菌株處理。由于防治效果與病情指數存在負相關的關系,即病情指數越大防治效果越差,病情指數越小防治效果越好。由圖4可知,在整體效果上,F1菌株對甜瓜枯萎病的防治效果要明顯大于D1、H3菌株,且F1-6處理對甜瓜枯萎病防效最好,其防效達到了70.6%。2.5srdna序列比對形態(tài)觀察表明,F1菌落呈奶酪色、表面光滑、邊緣規(guī)則,在液體培養(yǎng)基中呈沉淀性混濁,菌體桿狀,芽孢中生、橢圓形。根據以上的形態(tài)特征及表2的生理生化特征實驗結果,查《伯杰細菌鑒定手冊》及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》可知,菌株F1與Bacillusmethylotrophicus最相似。將菌株F1的16SrDNA序列在NBCI中進行比對,結果表明,菌株F1與BacillusmethylotrophicusCBMB205T(EU194897)的同源性達99.8%,從圖5也可以看出,菌株F1與BacillusmethylotrophicusCBMB205T(EU194897)親緣關系最近。綜合以上結果,菌株F1屬于Bacillusmethylotro-phicus。3不同菌株對甜瓜枯已病的抗治效果海南地處熱帶,屬熱帶季風氣候,被譽為“天然大溫室”,擁有豐富的微生物資源,這為拮抗菌的篩選提供了巨大空間。本研究從海南11個縣市甜瓜地、蔬菜地中分離純化到570株菌,經過初篩篩選到43株對病原菌具有拮抗作用的菌株。綜合復篩的平板對峙、遺傳穩(wěn)定性、發(fā)芽率3個實驗的結果,選擇了具有抑制作用、遺傳穩(wěn)定性良好和對種子發(fā)芽無抑制作用的拮抗菌株D1、F1、H3作為進一步盆栽試驗菌株,其結果顯示了F1菌株的F1-6處理表現了良好的生防效果,對甜瓜枯萎病的防治效果達到70.6%。自Baker等于1965年于伯克利提出生物防治土傳病害以來,關于利用生防菌防治甜瓜枯萎病的報道屢見不鮮。有文獻報道可作為甜瓜枯萎病病原拮抗菌的有木霉菌、芽孢桿菌、非致病性尖孢鐮刀菌、放線菌等。在國內防治效果試驗報道中,利用木霉菌T23、Ta22經復合處理之后對甜瓜枯萎病田間防效可達到79.00%;周婧等從黃瓜、南瓜、甜瓜的根莖部篩選到具有潛在生防價值的H-5,其溫室防效達到75.6%;王瑞菊等從土壤中篩選到4株對甜瓜枯萎病具有穩(wěn)定拮抗作用的芽孢桿菌,室內防效最好可達到75.32%。本試驗得出的室內防治效果達到70.6%,與上述報道的防治效果相差不大。進一步對F1菌株進行鑒定,確定該菌株為Bacillusmethylotrophicus(甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌)。Bacillusmethylotrophicus不僅在解磷、降解纖維素方面有相關報道,而且有大量報道顯示其有抗病功能;單宏英從陳化煙葉表面篩選到BC79(Bacillusmethylotrophicus菌株,發(fā)現BC79對煙草灰霉病菌、煙草炭疽病菌、煙草霜霉病菌、煙草立枯病菌、煙草赤星病菌等5種病菌都有抑制效果。馮云利等從烤煙品種NC297內生細菌中篩選到對煙草黑脛病有拮抗作用的菌株165株,其中67菌屬Bacillusmethylotrophicus。菌株An-ctc-y-1(Bacillusmethylotrophicus)的抑菌譜較廣,對稻瘟病菌、番茄灰霉病菌、梨黑星病菌、辣椒疫霉病菌、蘋果輪紋病菌的抑制效果達到90%以上。R2-2(Bacillusmethylotrophicus)對水稻條斑病菌和水稻白葉枯病菌有較強的抑菌效果,抑菌圈直徑分別為7.03、6.83cm。本試驗中篩選到菌株F1在抗甜瓜枯萎病上表現出良好的防治效果,在一定程度上豐富了Bacillusmethylotrophicus的抗病譜。本試驗在平板對峙實驗中采用拮抗指數來評價拮抗效果,這有別于大多數文獻采用抑菌率、抑菌圈的評價方法。這是由于不同微生物的在同一生長條件下,其生長速度不一樣,從而造成菌落大小不一,產生拮抗物質的能力也不同,如果僅以抑菌率