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ComparisonofP1and16SrRNAgenesfordetectionofMycoplasmapneumoniaebyoptimizednestedPCRinadultpatientsinZhejiang,China匯報(bào)人：周子博Mycoplasmapneumoniaeisafrequentcauseofcommunity-acquiredpneumoniafor10-40%inchildrenandadults.BecauseofthetreatmentofM.pneumoniainfectionwithβ-lactamantibioticsisineffectiveandtheclinicalmanifestationsofM.pneumoniaeinfectionarecomplicatedandnonspecific,soarapid,sensitiveandspecificlaboratorytestisvitalforearlydiagnosisofM.pneumoniaeinfection.ConventionaltestsfordetectingM.pneumoniaehavetheirlimitations.IntroductionIntroduction

SeveralPCR-relatedmethodsprovideenhancedsensitivityandhavebeensuccessfullyappliedforresearchpurposessuchasnestedPCR.TheP1adhesiongeneandthe16SrRNAgenehavebeenutilizedwidelyinPCRtechniquesasthetargetsfordetectionofM.pneumoniae.Inthisstudy,wesoughttoidentifythemoresensitiveandspecifictarget(P1or16SrRNA)inM.pneumoniaedetectionandtoevaluatetheuseofnestedPCRforthediagnosisofMPinfectionfrompatientsinwhomM.pneumoniaewassuspected.MaterialsandmethodsStrainsandclinicalsamplesDNApreparationOrthogonalarraydesignOptimizationofsinglefactorconditionsNestedPCRsensitivitytestDetectionofclinicalsamplesOrthogonalarraydesign

FactorsLevels123Primer(μΜ)0.10.30.5Mg2+(mM)1.52.54Annealingtemperature(℃)58(54)60(56)62(58)DilutionmultipleNO50100Table1NestedPCRfactorsandtheirlevelsfororthogonalprojects(Theannealingtemperatureof16SrRNAgeneisexpressedinthebrackets)Orthogonalarraydesign

FactorsReactionPrimer(μΜ)Mg2+(mM)AnnealingDilutionmultipletemperature(℃)10.11.558(54)NO20.12.560(56)5030.1462(58)10040.31.560(56)10050.32.562(58)NO60.3458(54)5070.51.562(58)5080.52.558(54)10090.5460(56)NOTable2OrthogonalarraydesignfornestedPCR(Theannealingtemperatureof16SrRNAgeneisexpressedinthebrackets)

Figure1:ElectrophoresisanalysisofvariednestedPCRproductsofMycoplasmapneumoniaeFHwiththetargetoftheP1adhesion(16SrRNA)gene.M1234567

8

9100bp→150bp→←107bpM123456789144bp150bp→P1gene16SrRNASinglefactorexperiment

Atlast,wedeterminedthefinaloptimalnestedPCRreactionconditions:FortheP1gene,theoptimalcombinationofMg2+concentration3mM,primerconcentration0.3uM,annealingtemperature60℃,thefirstroundPCRproduct50-folddilution;Forthe16Sgene,themostexcellentcombinationofMg2+concentration3mM,primerconcentration0.3uM,annealingtemperature56℃,thefirstroundPCRproduct50-folddilution.P1gene16SrRNANestedPCRsensitivitytestsensitivitiesofnestedPCRforM.pneumoniae:LaneM:DNAmarker.Lane1:20ngofM.pneumoniaeFHstrain;Lane2:10ng;Lane3:10-1ng;Lane4:10-2ng;Lane5:10-3ng;Lane6:10-4ng;Lane7:10-5ng;Lane8:10-6ng;Lane9:

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