TUbulinPolymerizationAssayKit(Cytoskeleton-Cat.#BK011P)一、 微管體外聚合實驗分為3個時相，成核期、生長期、平6期。Paclitaxel會消除成核期并增加生長期的Vmax,而Nocodazole則導(dǎo)致Vmax誠少和聚合雖減少。微管蛋白（tubuhn）由55kDa的aB微管蛋白組成，真核中保守，故采用豬腦提取。tubuhn聚合時先形成proto-filaments再形成microtubules□Tubulin體外能從2端聚合但休內(nèi)聚合速度不同，快速聚合端稱plus-end位于微觀組織中心;慢速端稱minus-end。二、 試劑盒組成粗分描述Bufierl(Part#BP01)2管，干粉，每管加10nxL超純水配成l^bufier.包括80mMPIPES.2niMMgCh.0.5mMEGIA.pH6.9.10pM熒光報告基團GTPstock(Cat.#BST06-001)3管.干粉.每管加入100j.iL滅菌水配成1OOniMstocksolutionTxiulin飯白(Cat,#T24O.DX)含有10mg凍干微管蛋白，從豬腦純化，＞99%純度，白色粉末TAulmGly:erolBufier(Cat.#BST05-001)1管.10mL,包括SOniMPIPES,2mMMgCh.0.5mMEG7A.60%甘油,pH6.9Paclitaxel(CatttTXDOl)1管.干粉.加入IOOmLDMSO配成2mM母液DMSO1管.lmL,配制Paclitaxel用Halfarea96wellplate1塊.黑.平底.ComingCostarCat的686三、試劑盒重構(gòu)（-80度保存6個月）1、Buffer1（Part#BP01）：每管加10ml超純水，2管混勻，13X1.5mU管分裝（2mLEP管）2、 GTPStock（Cat.#BST06-001）：每管加100皿滅菌水,3管混勻,13X20^L/管分裝（0.5mLEP管）3、 Tubulin蛋白（Cat.#T24O＞DX）：a、 將12個標有"tubulinstock,1Omg/mL”的凍存管置于冰上預(yù)冷b、 20jiL（1管）lOOmMGTPstock冰上解凍，將15凹的100mMGTPstock與1.5mL（1管）冰預(yù)冷的Buffer1混勻，取l.lmL的Buffer1（含GTP）重懸Tubuhn粉末，冰上放置2分鐘以徹底重懸c、 12XS8HL分裝，田液氮中瞬間冷凍（dropfreeze）局,于-80度保存，每管可用于6-$個assay4、 Paclitaxel（Cat.#TXD01）：加入100匹的DMS。5、 TubulinGlyceiolBuffer（CushionBuffer）（Cat.#BST06-001）：無需重構(gòu)，4度保存四、使用步驟1、儀器設(shè)置為動態(tài)讀值，1分鐘1讀共60分鐘（有時可縮為30分鐘），激發(fā)波長360血發(fā)射波長450nm,當scale最大值為120時gain設(shè)為80,每孔讀值3次?integration設(shè)置為（MOps,振動設(shè)為5s（Medium,orbital-firstreadonly?）,板子使用ComingCostar96-wellplate（CormngCostar,Cat.#3686）。將100|iL的10倍稀釋的buffer1加入每孔中并激活NwTenplateScanProcedurec2、 將96孔板（ComingCostar.Cat#3686）置于酶標儀中，37度預(yù)熱10分鐘。3、 將paclitaxel母液解凍，5■加入325pL滅菌水,得30^Mpaclitaxel（10X母液）,使用前置室溫。4、 化合物配成2mM母液再水中稀釋成10X母液,10mM化合物1：100至水再1：10至測活體系成10mM。5、 直到化合物準備好了再開始下面的實驗。6、 1.5mL（1管）的Bufferl解?東后置于冰上。7、 20|iL（1管）的GTPstock解凍后置于冰上。8＞將TubulinGlycerolBuffer從4度取出置于冰上。9、88nL（1管）tubulin（880^g，即10mg/mL）際溫水浴中迅速解凍后置于冰上|以免微管聚合。

10、速將Bufferl>TubulinGlycerolBuffer>GTPstockTubulinStock按下表制成反應(yīng)液，冰上可放lh。Component|共444.4pl可用于8個孔StandardConditionsInhiiitorDetectionEnhancerDetectionFinalConcentrationBuffer1243pL205或管）7355pLIXTubulinGlycerolBuffer112pLISOpLNoneVanesGTPstock(100mM)4.4pL4.4pL(Iff)444j.iLImMTubulinstock(1Onig/mL)85pL85pL(1管)2nig/niL11、 兩副孔，5“L對照buffer（與溶解化合物的buffer—致）加入Al&B1,5.的lOXpaclitaxel加入Cl&D1,5皿的10X測試的化合物加入El&Fl,宜到所有化合物加完。12、 將加有Ipl化合物的板子放于酶標儀預(yù)熱1分鐘（不得超過1分鐘以免蒸干）。13、 96孔板每孔加入50頭1的反應(yīng)液，要快旦使用適當速度貼孔壁排液以避免產(chǎn)生氣泡。14、 立刻讀數(shù)，如果開始后5分鐘內(nèi)出借可重新讀數(shù)。五、注意事項注1：lOXinhibitor陽性對照：5“L的5mM氮化鈣溶液或30^tMNocodazole/vinblastine（長春堿）/colchicine（秋水仙素）：10Xenhancer陽性對照：30|iMPaclitaxel,kit中初始濃度為2mMo注2：8個孔內(nèi)可單道加，1分鐘加完；超過8個孔需排槍加：避免產(chǎn)生氣泡，可用2mg/mL的BSA蛋白溶液練習注3：標準的反應(yīng)體系包括2mg/mL微管，80mMPIPESpH6.9,2.0mMMgCl2>0.5mMEGTA,l.OmMGTP和15%H油。|要優(yōu)化對inhibitor的檢測采用20%甘油.檢測enhancer則采用15%甘油|。注4：讖管必須放冰上直到加入96孔板櫥在加入微管前幽96孔板。注5：微管要在分裝前在|液氮中速凍|后再置于-80度視保存:且凍存前微管蛋白濃度要因于6mg/mL|°注6：測活標準條件是|2mg/mL微管+lmMGTP+15%甘油的Buffer促進解聚屎用更高濃度微管蛋白產(chǎn)生高信號：限進聚合|不用/用低濃度甘油有助于檢測，如不加甘油微管不會聚合而paclitaxel則會促進聚合。如果要找通過結(jié)合微管疏水口袋而促進微管解聚化合物則可不加甘油并增加微管含量或者使用MAPs（不是通過與微管疏水口袋結(jié)合而是通過離子性結(jié)合K注7：1個單位的微管（100瞄，55卜iL）加入1個孔，于30分鐘后達最大熒光值（強度增31倍）。六、Troubleshooting技術(shù)支持：tservice@問題解決方案沒有聚合1） 340.360nm（激發(fā)），410-460nm（發(fā)射）2） 動態(tài)讀值.30s~lmm讀一次數(shù)值波動1） 所有步驟嚴格遵守，CV值在11%2） 需要GTP的bufier冰上放置時間不超過4h.超過4h后丟棄，不可重復(fù)使用實驗間的不一致的聚合結(jié)果1） 微管蛋白失活.可能由不正確凍存導(dǎo)致：10mg/mL濃度微管于液^中速凍旦不可凍融使用：保存時蛋白濃度要高于6mg/mL：干粉受潮所致2） 聚合時嚴格控制在37度，測活前96孔