口腔念珠菌病與血清學(xué)相關(guān)性研究

口腔感染是由真菌菌感染引起的口腔粘膜損傷引起的。白色念珠菌是普遍存在于人體內(nèi)的條件致病菌,約25%～50%的健康人口腔內(nèi)有念珠菌存在,與其他微生物共同作用,維持著口腔環(huán)境的生態(tài)平衡。從口腔中分離出念珠菌并不意味著有病損出現(xiàn),免疫系統(tǒng)的完整性能有效控制白色念珠菌的感染。本研究通過觀察口腔念珠菌病臨床類型與唾液念珠菌菌落形成單位(colonyformingunits,CFU)計數(shù)之間的關(guān)系;同時,定量分析口腔念珠菌病病人外周血單核細胞TNF-α和IL-5水平,初步探討白色念珠菌感染時的免疫反應(yīng)情況。1材料和方法1.1rpmi-1330培養(yǎng)基沙堡氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Oxoid公司,英國);RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO公司,美國);TNF-α檢測試劑盒、IL-5檢測試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司)。1.2研究對象和排除標準選擇口腔黏膜病科診斷為念珠菌性口炎的病人29例(其中假膜型9例,紅斑型18例,肥厚型2例)作為研究對象,另選10例口腔健康者做為對照。納入標準:年齡>18歲,性別不限,口腔內(nèi)有牙或活動義齒修復(fù)的健康成人。排除服用皮質(zhì)激素或其他免疫抑制藥物、服用抗真菌藥物、糖尿病病人和HIV陽性者。所有受試者均知情同意并自愿參加。1.3cfu的測定所有受試者于上午9:00～11:00時用10mL無菌PBS緩沖液含漱1min,收集2mL含漱液置沙堡葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,用無菌生理鹽水以1∶3稀釋,取1.0mL稀釋液均勻涂布于平板,37℃孵化48h,計算培養(yǎng)基上菌落數(shù)即獲得CFU計數(shù)。1.4細胞因子的檢測1.4.1凍融法提取蛋白將從口腔念珠菌病病人唾液中分離出的念珠菌接種于沙堡葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,經(jīng)3000r/min離心30min,PBS洗3次,懸于0.5mol/L氫氧化鈉液,反復(fù)凍融20次,離心后收集上清液并調(diào)pH值至7.3,Lowry法測定蛋白。繪制劑量-反應(yīng)曲線,確定最適宜白色念珠菌的抗原濃度為0.05μg/mL。1.4.2外周血單核細胞的制備取所有受試者晨間空腹靜脈血5mL,肝素抗凝,分離血漿,Ficoll-hypaue密度梯度離心,分離出的外周血單核細胞用生理鹽水洗3次,重懸于RPMI1640培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)細胞密度至3×106/mL,接種于24孔平板并用0.05μg/mL白色念珠菌抗原刺激,CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育72h,收集上清液并于-70℃保存。分別按TNF-α、IL-5檢測試劑盒說明,用ELISA雙抗體夾心法檢測TNF-α、IL-5水平。1.5統(tǒng)計分析采用SPSS10.0軟件進行t檢驗,顯著性標準α=0.05。2結(jié)果2.1計數(shù)口腔健康者計數(shù)菌落計數(shù)1～621CFU/mL,平均(284±274)CFU/mL,所有口腔健康者計數(shù)均低于100CFU/mL,而有病損者多超過100CFU/mL(表1)。2.2il-5和-水平差異口腔念珠菌病組唾液白色念珠菌CFU計數(shù)、TNF-α水平均明顯高于口腔健康對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而IL-5水平兩組相比無顯著性差異(P>0.05)(表2)。3cfu值的統(tǒng)計方法是否能夠反映疾病的表面效應(yīng),主要解決細菌計數(shù)和細菌計數(shù)口腔黏膜、陰道黏膜最容易受白色念珠菌侵襲,有研究表明:口腔白色念珠菌感染時,唾液菌落形成單位升高,同時伴有CD4+細胞的減少。本研究通過觀察口腔念珠菌病與唾液念珠菌菌落形成單位計數(shù)之間的關(guān)系,同時檢測單核細胞分泌TNF-α和IL-5水平,初步探討口腔念珠菌病的微生物特性和免疫反應(yīng)情況。白色念珠菌作為條件致病菌,與其他微生物共同作用,相互黏附,維持著口腔中的正常生態(tài)平衡,在唾液中檢測出念珠菌并不意味著有病損出現(xiàn),但其存在是臨床發(fā)病的必要條件,且有研究發(fā)現(xiàn)高密度克隆與口腔念珠菌病發(fā)展有關(guān)。因此,對念珠菌菌落進行量化分析有助于研究菌落數(shù)與念珠病發(fā)病的關(guān)系。菌落形成單位(CFU)是計算細菌數(shù)量的一種方法,其值越高表示樣品中所含的細菌越多,計量方式也與一般的計數(shù)方式不同,細菌計數(shù)是直接在顯微鏡下計算細菌數(shù)量,通常會將活菌和死菌全部計入,而CFU只計算活的細菌,更能說明問題。本研究結(jié)果顯示:所有無病損者菌落計數(shù)均<100CFU/mL,29名白色念珠菌病人有21名菌落計數(shù)>100CFU/mL。提示CFU計數(shù)與疾病的發(fā)生有關(guān)。宿主免疫功能直接影響機體抵抗病原菌的能力,有研究表明:局部或全身的先天性或獲得性免疫功能在維持白色念珠菌共生菌狀態(tài)中發(fā)揮作用,非特異性和特異性免疫功能,特別是細胞免疫功能在對抗口腔念珠菌感染中起重要作用。Th1與Th2反應(yīng)的平衡機制參與抗真菌免疫反應(yīng)過程,CD4+細胞是具有免疫活性的T細胞,其接受細胞因子作用后,一方面增生分化為Th1細胞,通過釋放TNF等細胞因子引起炎癥反應(yīng);另一方面可增殖分化為Th2細胞,通過釋放IL-4、5、6、10等細胞因子誘導(dǎo)B細胞增殖分化產(chǎn)生抗體。TNF-α是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細胞因子,參與機體的免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng),也是某些感染性疾病和肝臟損傷的致病因素。當機體感染口腔念珠菌時,TNF-α能夠激活效應(yīng)細胞,起到黏膜防御白色念珠菌感染的作用。本研究顯示,念珠菌病病人外周血單核細胞中TNF-α明顯高于口腔健康者,提示口腔白色念珠菌感染,可能導(dǎo)致TNF-α誘導(dǎo)的系統(tǒng)免疫反應(yīng)。MdncacciA研究發(fā)現(xiàn):Th2細胞能夠降低機體對白色念珠菌的抵抗力,Th2活性高,機體對白色念珠菌易感。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn):慢性黏膜白色念珠菌病病人的外周血T淋巴細胞產(chǎn)生的IL-5高于正常人。而本研究顯示:口腔念珠菌病病人與口腔健康人抗原刺激培養(yǎng)物中IL-5表達無顯著性差別,這可能是由于其他細胞因子的拮抗作用引起的。因此免疫反應(yīng)在控制白色念珠菌引起的口腔念珠菌病中起到重要作用,機體在感染