基因重組與基因工程第十六章第二節(jié)工具酶第三節(jié)自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組第一節(jié)概述第四節(jié)基因載體第五節(jié)目的基因第六節(jié)重組DNA技術(shù)的基本過程第七節(jié)基因工程在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用第十五章基因重組與基因工程分子克?。涸隗w外對(duì)DNA分子按照既定的目地和方案進(jìn)行人工重組，將重組DNA分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞中，使其在細(xì)胞中擴(kuò)增繁殖，以獲得目地DNA分子的大量拷貝，并使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的過程。基因工程：利用分子克隆技術(shù)操作目地基因，并改變生物遺傳性狀的過程，即采用類似工程技術(shù)的方法，在體外進(jìn)行基因重組，使重組基因在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中得到表達(dá)。第一節(jié)概述結(jié)束放映返回目錄第二節(jié)工具酶指能用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、反轉(zhuǎn)錄等基因操作有關(guān)的各種酶系，統(tǒng)稱為工具酶。結(jié)束放映返回目錄結(jié)束放映返回目錄常用的工具酶(接下表)DNA連接酶連接雙鏈DNA分子中的單鏈切口形成磷酸二酯鍵 工具酶名稱 主要功能DNA聚合酶I5`→3`DNA聚合酶活性限制性核酸識(shí)別雙鏈DNA的特異序列，切割DNA5`→3`外切酶活性3`→5`外切酶活性內(nèi)切酶常用的工具酶工具酶名稱 主要功能在3`-OH末端進(jìn)行同一多聚物加尾反轉(zhuǎn)錄酶DNA末端轉(zhuǎn)移酶堿性磷酸酶去除DNA、RNA、dNTP的5`磷酸基團(tuán)結(jié)束放映返回目錄以RNA或DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的cDNA鏈，水解雜化雙鏈中的RNATaqDNA聚合酶能在高溫（72℃）下，以單鏈DNA為模板，從5`→3`方向合成新生的互補(bǔ)DNA鏈 <一>限制性核酸內(nèi)切酶按限制性核酸內(nèi)切酶的分解模式，分為三類類型I

有識(shí)別位點(diǎn),切割長(zhǎng)短不一且無特異性類型II具有識(shí)別和切割的特異性，切割后產(chǎn)生粘性末端或平頭末端類型III

界于I和II之間1、限制性核酸內(nèi)切酶的分類結(jié)束放映返回目錄①均能嚴(yán)格地識(shí)別特定核苷酸的序列（4－8個(gè)堿基對(duì)）。②大多數(shù)識(shí)別位點(diǎn)具有180度旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的結(jié)構(gòu)形式（回文結(jié)構(gòu)）。③能在識(shí)別的核苷酸序列當(dāng)中或附近切割雙鏈DNA。2、II型酶識(shí)別序列特點(diǎn)：結(jié)束放映返回目錄3、II型限制性內(nèi)切酶的切割方式三種切割方式

一種是在對(duì)稱軸5`側(cè)切割產(chǎn)生5`粘端，

EcoRI

5`----NGAATTCN----3`

5`----NG

AATTGN----3`結(jié)束放映返回目錄3`----NCTTAAGN----5`3`----NCTTAACN----5`5`粘性末端GAATTCCTTAAG結(jié)束放映返回目錄另一種是在對(duì)稱軸的3`側(cè)切割產(chǎn)生3`粘端，PstI5`----NCTGCAGN----3`3`----NGACGTCN----5`CTGCAGGACGTC5`----NCTGCA3`----NGCTGCAGGN----3`ACGTCN----5`GACGTC3`-粘性末端第三種切割方式是在對(duì)稱軸處切割，就產(chǎn)生平末端SmaI5`----NCCCGGGN----3`3`----NGGGCCCN----5`CCCGGGGGGCCC5`----NCCC3`----NGGGCCCGGGGGGN----3`CCCN----5`GGGCCC平頭末端結(jié)束放映返回目錄4、某些限制性內(nèi)切酶的識(shí)別切割序列結(jié)束放映返回目錄HindⅢNotⅠPstⅠPvuⅡTthⅢBamHⅠClaⅠEcoRⅠEcoRⅤHaeⅢ5`---GGATCC---3`

5`---ATCGAT---3`

5`---GAATTC---3`

5`---GATATC---3`

5`---GGCC---3`

5`---AAGCTT---3`

5`---GCGGCCGC---3`

5`---CTGCAG---3`

5`---CAGCTG---3`

5`---GACNNNGTC---3`

<二>DNA連接酶連接雙鏈DNA分子中的單鏈切口,形成磷酸二酯鍵主要應(yīng)用：DNA片段粘性末端連接。DNA片段平頭末端連接（效率低100-200倍）

結(jié)束放映返回目錄OH5`5`3`3`P連接酶5`5`3`3`<三>末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶能催化dNTP依次聚合到DNA的3`末端。以3`端突出的DNA末端最好。主要應(yīng)用：給目的DNA、cDNA和載體加上互補(bǔ)的多聚脫氧核苷酸尾巴(人工粘性末端)。結(jié)束放映返回目錄結(jié)束放映返回目錄5’3’3’5’5’5’3’3’載體DNA+dGTP目的DNA+dCTP末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶3’3’3’3’PolyGPolyGPolyCPolyCPolyGPolyC同聚物加尾連接法<四>逆轉(zhuǎn)錄酶以

mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成與mRNA互補(bǔ)的DNA。合成的產(chǎn)物稱cDNA(complementaryDNA)主要應(yīng)用：逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA及DNA探針，補(bǔ)平和標(biāo)記粘性末端。結(jié)束放映返回目錄mRNA3`…AAAAAA…5`TTTTTT…5`逆轉(zhuǎn)錄酶4種dNTPRNA-DNA…AAAAAA…5`3`3`TTTTTT…5`結(jié)束放映返回目錄RNA-DNA雜交體的生成<五>DNA聚合酶I?主要應(yīng)用：DNA序列分析、催化DNA切口平移制備探針、DNA3`端標(biāo)記、cDNA第二鏈的合成。結(jié)束放映返回目錄第三節(jié)自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組---細(xì)菌中遺傳物質(zhì)的幾種轉(zhuǎn)移形式:接合轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)座結(jié)束放映返回目錄接合染色體DNAF因子轉(zhuǎn)移細(xì)菌接合：指通過細(xì)菌鞭毛的直接接觸，遺傳信息從供體細(xì)胞單向轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的過程。1、接合作用結(jié)束放映返回目錄供體細(xì)胞受體細(xì)胞2、轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化：自動(dòng)的獲取或人為的供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型。細(xì)胞溶解新細(xì)菌攝取DNA重組圖15-2轉(zhuǎn)化作用結(jié)束放映返回目錄供體細(xì)胞受體細(xì)胞3、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過病毒或噬菌體介導(dǎo)發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組。溶菌感染重組感染細(xì)菌噬菌體結(jié)束放映返回目錄供體細(xì)胞受體細(xì)胞4、轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座：由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移或重排。

結(jié)束放映返回目錄第四節(jié)基因載體一、載體的概念攜帶和運(yùn)載目的DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的一些DNA分子,它可以使目的DNA隨著宿主細(xì)胞的增殖而無性繁殖或/和在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的DNA。可分為克隆載體和表達(dá)載體。

結(jié)束放映返回目錄作為載體的DNA分子有質(zhì)粒DNA，噬菌體DNA和病毒DNA等。它們經(jīng)人為改造后在宿主細(xì)胞中只具有自我復(fù)制能力的DNA為克隆載體；能使插入的目的DNA無性繁殖，并使其在宿主細(xì)胞中表達(dá)而特意設(shè)計(jì)的DNA為表達(dá)載體。結(jié)束放映返回目錄二、載體的種類質(zhì)粒：是存在于細(xì)菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀DNA，能在宿主細(xì)胞中獨(dú)立地復(fù)制，并在細(xì)胞分裂時(shí)傳遞給子代細(xì)胞，其DNA分子上的基因?qū)λ拗骷?xì)胞的代謝活動(dòng)和抗藥性的表型均有一定的作用?？少x予細(xì)菌特定的表型，如抗生素抗性，是篩選轉(zhuǎn)化子細(xì)菌的遺傳標(biāo)志。結(jié)束放映返回目錄pUC192686bpEcoRISaclKpnlSmalXmalBamHlXbalHincllPstlSphlHindlllamprlacllacZ`ori0447Amlll806Ppai1765Ctr10i11779Gsul1784Scal2177Xmnl2294Sspl2501Aatll26117EcoO1092674Ndel183Narl235Plac質(zhì)粒pUC19結(jié)束放映返回目錄三、載體的特點(diǎn)1、載體必須是復(fù)制子，在宿主細(xì)胞中能大量復(fù)制。2、同一限制性核酸內(nèi)切酶在載體上只有單一酶切位點(diǎn)。3、具有選擇性遺傳標(biāo)志。一、概念為基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的需要而分離獲得的某一感興趣的基因（DNA序列），或者是為得到某一感興趣的蛋白質(zhì)或RNA所對(duì)應(yīng)的DNA序列。有兩種類型，既cDNA和基因組DNA。二、目的基因的獲?。ㄒ姾螅┑谖骞?jié)目的基因結(jié)束放映返回目錄第六節(jié)重組DNA技術(shù)的基本過程制備目的基因和相關(guān)載體。將目的基因和載體進(jìn)行體外連接。將重組的載體DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。DNA重組體的篩選和鑒定。DNA重組體的擴(kuò)增表達(dá)。結(jié)束放映返回目錄載體+重組子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染目的DNA細(xì)菌重組DNA增殖篩選含重組質(zhì)粒的細(xì)菌（以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過程）結(jié)束放映返回目錄陽(yáng)性克隆的篩選及擴(kuò)增一、目的基因的獲取1、從基因組DNA中分離獲得2、從基因文庫(kù)中篩選獲得（基因組文庫(kù)及cDNA文庫(kù)）3、化學(xué)合成法4、PCR擴(kuò)增5、mRNA逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束放映返回目錄1、從基因組DNA文庫(kù)中篩選獲得（1）基因組DNA文庫(kù)：分離組織或細(xì)胞染色體DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶將其切割成許多片段后將它們與克隆載體拼接成重組DNA，將所有的重組DNA分子都引入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體稱基因組DNA文庫(kù)。結(jié)束放映返回目錄（2）文庫(kù)的篩選：直接選擇法：抗藥性選擇、分子探針、標(biāo)志補(bǔ)救（如α-互補(bǔ)篩選）。

免疫學(xué)方法：利用特異抗體與目的基因表達(dá)產(chǎn)物相互作用進(jìn)行的篩選（如酶免檢測(cè)分析）。結(jié)束放映返回目錄多克隆位點(diǎn)啟動(dòng)子裂開的N端裂開的N端外源DNA半乳糖苷酶N端編碼序列染色體重組體pUC18細(xì)菌在含X-gal和乳糖操縱子誘導(dǎo)劑的瓊脂上培養(yǎng)細(xì)菌在含X-gal和乳糖操縱子誘導(dǎo)劑的瓊脂上培養(yǎng)pUC18含重組體pUC18的白色菌落藍(lán)色菌落含載體pUC18的藍(lán)色菌落半乳糖苷酶C端編碼序列轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化amprAmpr(利用互補(bǔ)原理篩選重組子Puc18)pUC182686bppUC182686bp結(jié)束放映返回目錄藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒與PCR鑒定重組質(zhì)粒結(jié)束放映返回目錄硝酸纖維膜菌落瓊脂培養(yǎng)板硝酸纖維膜復(fù)制培養(yǎng)溶菌、中和蛋白酶處理漂洗、烘干1、32P探針雜交2、放射自顯影鑒定克?。ê信d趣DNA）原位雜交結(jié)束放映返回目錄2、從cDNA文庫(kù)中篩選獲得（1）cDNA文庫(kù)：將總mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，再?gòu)?fù)