#緒論第一節(jié)ThebirthofGeneticEngineering一．基因工程的定義在體外對(duì)不同生物的遺傳物質(zhì)（基因）進(jìn)行剪切、重組、連接，然后插入到載體分子中（細(xì)菌質(zhì)粒、病毒或噬菌體DNA），轉(zhuǎn)入微生物、植物或動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無(wú)性繁殖，并表達(dá)出基因產(chǎn)物。二．基因工程誕生的理論基礎(chǔ)DNA是遺傳物質(zhì)（1）肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（2）噬菌體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)三．基因工程誕生的技術(shù)突破限制性?xún)?nèi)切酶（restrictionenzymes）DNA連接酶（ligase）載體（vector）感受態(tài)體系（competence）瓊脂糖凝膠電泳6.DNA測(cè)序技術(shù)四．基因工程的誕生Berg的開(kāi)創(chuàng)性實(shí)驗(yàn)Boyer-Cohen實(shí)驗(yàn)六．基因工程的特征跨物種性無(wú)性擴(kuò)增七．基因工程的主要操作內(nèi)容目的基因的獲取重組體的制備重組體的轉(zhuǎn)化克隆鑒定目的基因表達(dá)第二節(jié)基因工程的安全性一、基因工程的安全隱患對(duì)環(huán)境的影響新型病毒的出現(xiàn)癌癥擴(kuò)散人造生物擴(kuò)散二、重組DNA研究的安全準(zhǔn)則公眾的擔(dān)憂(yōu)專(zhuān)家的態(tài)度制定安全規(guī)則基因工程的安全措施（1）實(shí)驗(yàn)室的物理安全分4級(jí)：P1—P4級(jí)。（2）實(shí)驗(yàn)室的生物安全分3級(jí)（大腸桿菌）：EK1—EK3級(jí)。（3）載體的安全第三節(jié)基因工程的應(yīng)用一、基因工程在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提高植物的光合作用效率（1）提高CO2的固定率（2）提高光能吸收率和轉(zhuǎn)化率提高豆科植物的固氮效率轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物二、基因工程在工業(yè)中的應(yīng)用纖維素的開(kāi)發(fā)利用釀酒工業(yè)三、基因工程在醫(yī)藥上的應(yīng)用用轉(zhuǎn)基因植物或動(dòng)物生產(chǎn)藥物用微生物生產(chǎn)藥物技術(shù)設(shè)計(jì)高效高特異性的生物制劑研制疫苗基因診斷法醫(yī)鑒定基因治療四、基因工程在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用檢測(cè)水污染生物降解第四節(jié)基因工程技術(shù)的商業(yè)化發(fā)展一、商業(yè)投資支持現(xiàn)代生物技術(shù)研究二、基因工程商業(yè)化特點(diǎn)技術(shù)密集型（1）產(chǎn)品來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室（2）科學(xué)家往往就是公司的領(lǐng)導(dǎo)人市場(chǎng)擴(kuò)張迅速投入巨大風(fēng)險(xiǎn)太高產(chǎn)品不斷增加研究專(zhuān)一、產(chǎn)品專(zhuān)一醫(yī)學(xué)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)進(jìn)展最快專(zhuān)門(mén)為基因工程實(shí)驗(yàn)提供研發(fā)試劑的公司第一章基因工程的主要技術(shù)原理第一節(jié)DNA的提取與純化一、質(zhì)粒DNA的提取1.堿抽提法提取質(zhì)粒DNA（1）原理閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快；染色體線(xiàn)性DNA和或有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)一SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時(shí)候沉淀下去。（2）所用的試劑作用溶菌酶能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的0-1,4糖苷鍵。在堿性條件（pH>8）下有活性。葡萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械力（震蕩）的作用而降解。EDTAMg2+、Ca2+的螯合劑，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。NaOH-SDSNaOH：強(qiáng)堿，提供pH>12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。SDS:溶解細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成“蛋白—SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括DNA酶）變性沉淀。NaAc-HAc緩沖液冰醋酸把醋酸鈉溶液的pH調(diào)到4.8。用來(lái)中和NaOH變性液，使DNA復(fù)性。乙醇用于沉淀DNA。RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。TE緩沖液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。酚-氯仿蛋白變性劑，進(jìn)一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。但苯酚會(huì)殘留在DNA溶液中。（3）堿抽提法提取質(zhì)粒DNA的步驟第一步：溶菌使用“溶液I”溶解細(xì)菌細(xì)胞壁。第二步：破膜，蛋白質(zhì)和DNA變性溶液II破壞細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)和DNA變性。第三步：中和溶液III使DNA復(fù)性、并促使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和染色體DNA、RNA沉淀。第四步：離心除去沉淀上清液中含有閉合質(zhì)粒DNA。第五步：純化DNA上清液過(guò)柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA2.影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素（1）受體菌株一般要使用endA基因發(fā)生突變的大腸桿菌菌株。（2）質(zhì)?？截悢?shù)這是直接決定DNA產(chǎn)量的重要因素之一。質(zhì)粒本身的性質(zhì)所決定。（3）質(zhì)粒大小分子量大的質(zhì)粒，拷貝數(shù)少。二、基因組或其他DNA的提取1.細(xì)菌基因組DNA的制備（1）細(xì)胞裂解10%SDS和蛋白酶K。37oC溫育。不用NaOH!（2）DNA純化CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）除去多糖，酚-氯仿-異戊醇除去蛋白。（3）沉淀DNA0.6倍體積的異丙醇。哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA的抽提（1）組織粉碎動(dòng)物組織剪成小塊，置液氮中凍結(jié)后研磨成細(xì)粉末。組織培養(yǎng)的細(xì)胞用胰酶消化松散后直接使用。（2）細(xì)胞裂解0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50°C溫育。（3）純化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。（4）沉淀DNA用2倍體積的無(wú)水乙醇。（5）除去RNA污染從植物組織中制備DNA（1）組織粉碎用液氮冷凍后研磨成細(xì)粉末。（2）細(xì)胞裂解用2%CTAB/2-ME（十六烷基三甲基溴化銨/2巰基乙醇）?；?%SDS和蛋白酶K。65oC溫育。（3）純化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。（4）沉淀DNA用0.6倍體積的異丙醇（-20oC）。（5）除去RNA污染用RNaseA。三、DNA的定量和純度測(cè)定1.紫外光譜法原理：DNA（或RNA）在260nm波長(zhǎng)處有特異的紫外吸收峰。用微量比色杯（10“1）在紫外分光光度計(jì)直接測(cè)定。2.瓊脂糖凝膠電泳估計(jì)原理：溴化乙錠（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能發(fā)紅色熒光。與已知濃度的DNA電泳帶熒光強(qiáng)度對(duì)比，就可以估計(jì)出DNA含量。四、DNA分子量的估計(jì)一般使用瓊脂糖凝膠電泳，與已知分子量的DNA標(biāo)準(zhǔn)混合液對(duì)比得知。第二節(jié)DNA的凝膠電泳一、電泳的基本原理帶電荷的分子在電場(chǎng)中會(huì)以一定的速向與其電荷性質(zhì)相反的電極移動(dòng)，速度稱(chēng)為電泳遷移率。電泳遷移率同電場(chǎng)的強(qiáng)度和分子本身所帶的凈電荷數(shù)目成正比。電泳遷移率同分子與介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比。摩擦系數(shù)主要與分子的大小、形狀以及介質(zhì)的粘度有關(guān)。如果電場(chǎng)強(qiáng)度一定（電壓和電極距離）、電泳介質(zhì)相同（電泳液和凝膠）：（1）分子在電場(chǎng)中遷移的速度主要取決于分子本身的大小和形狀。（2）形狀相似的分子的遷移速度主要與分子量相關(guān):分子量越大，移動(dòng)越慢。相同分子量的DNA:（1）閉合環(huán)狀卷曲超螺旋遷移快，（2）線(xiàn)性分子次之，伸展開(kāi)環(huán)狀慢。二、瓊脂糖凝膠電泳1.瓊脂糖是一種線(xiàn)性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來(lái)2.瓊脂糖凝膠瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點(diǎn)后溶解，冷卻后又凝固成均勻的的膠體“胨”。瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙（密度）。瓊脂糖凝膠的分辨力空隙大小決定其分辨分子大小的能力?？障缎。直媛矢撸盒》肿虞^易通過(guò)，而大分子難通過(guò)；空隙大，分辨率低：大小分子幾乎以同等速率通過(guò)。三、聚丙烯酰胺凝膠電泳優(yōu)點(diǎn)是比瓊脂糖凝膠的分辨率高的多。四、凝膠染色1.染料溴化乙錠。2.原理EB是扁平分子，能插入DNA堿基之間，但不與瓊脂糖結(jié)合。EB在300nm紫外光照射下能發(fā)紅色熒光，即可顯示DNA泳帶在凝膠中所處的位置。熒光強(qiáng)度與DNA含量及大小成正比。第三節(jié)核酸的分子雜交DNA-DNA或DNA-RNA鏈雜交。用放射性同位素（32P或1251）標(biāo)記的DNA或RNA探針。一、Southernblot用DNA（或RNA）探針檢測(cè)DNA樣品。二、Northernblot用DNA（或RNA）探針檢測(cè)RNA樣品。三、原位雜交原位雜交對(duì)應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽(yáng)性菌落。第四節(jié)基因擴(kuò)增技術(shù)PCR一、基因擴(kuò)增（geneamplification）指生物體內(nèi)或體外人工方式使基因拷貝數(shù)大規(guī)模增加。有下列五種方式：環(huán)境誘發(fā)擴(kuò)增在環(huán)境因子的誘發(fā)下，某些基因產(chǎn)生明顯的擴(kuò)增基因的程序性擴(kuò)增在發(fā)育的某個(gè)階段，某些基因的大量擴(kuò)增?；蚪M進(jìn)化擴(kuò)增生物進(jìn)化過(guò)程中基因組中某些基因的拷貝數(shù)增加，結(jié)果相關(guān)的基因聚集成簇?；蚬こ虜U(kuò)增載體攜帶目的基因在寄主細(xì)胞中大量復(fù)制。PCR擴(kuò)增應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)技術(shù)，在體外特異性地?cái)U(kuò)增某個(gè)基因。二、PCR技術(shù)PCR的發(fā)明PCR技術(shù)的原理(1)DNA模板變性95°C雙鏈DNA在受熱后，配對(duì)堿基的氫鍵斷裂，DNA兩條鏈分開(kāi)成為單鏈。(2)DNA模板與引物復(fù)性引物(primer):人工合成的單鏈DNA小片斷，堿基順序分別與所要擴(kuò)增的模板DNA雙鏈的5‘端相同。(3)DNA鏈的延伸DNA聚合酶按堿基配對(duì)原則在模板上延伸DNA鏈。(4)1個(gè)循環(huán)的結(jié)果(5)新一輪循環(huán)開(kāi)始PCR的過(guò)程(1)第一步變性(denature)94-95oC下5分鐘，模板DNA雙鏈完全變性成單鏈。(2)第二步復(fù)性(anneal)50-60oC下1分鐘，引物優(yōu)先與模板復(fù)性。①引物的濃度高，引物的鏈短。(3)第三步延伸(extend)72oC下1-2分鐘，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。(4)第四步變性(denature)94oC下1分鐘，新合成的DNA雙鏈又變性成單鏈模板。(5)第五步重復(fù)(repeat)PCR的特點(diǎn)(1)特異性強(qiáng)PCR使用專(zhuān)門(mén)合成的DNA引物。延伸過(guò)程是在高溫下進(jìn)行。(2)敏感性高需要的模板量極低。(3)快速整個(gè)PCR過(guò)程約4小時(shí)即可完成。(4)簡(jiǎn)便對(duì)模板的純度要求低。(5)可以擴(kuò)增mRNA5.影響PCR的因素(1)TaqDNA聚合酶①熱穩(wěn)定性②適溫度高Taq酶的功能缺點(diǎn)：不能修復(fù)錯(cuò)誤的堿基配對(duì)！TaqDNA聚合酶的激活劑金屬離子敏感(尤其是Mg2+)。(2)其它耐熱的DNA聚合酶TthDNA聚合酶無(wú)3'~5'DNA外切酶活性，但高溫下能逆轉(zhuǎn)錄cDNA，又能擴(kuò)增DNA。VENTDNA聚合酶有3‘一5‘外切酶活性，能夠校正堿基的錯(cuò)配。能耐受lOOoC高溫。PfuDNAPolymerase是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐高溫DNA聚合酶中出錯(cuò)率低的。但PCR產(chǎn)物為平端！TaqPlusDNAPolymerase是Taq和PfuDNA聚合酶的混合物。Taq的PCR產(chǎn)物3'端往往帶有一個(gè)A。(3)引物(primer)①位置與待擴(kuò)增的模板DNA區(qū)段的兩3'端序列互補(bǔ)(5‘端相同)的短DNA。引物的長(zhǎng)度理論計(jì)算：419=2.75X1011。一般引物設(shè)計(jì)為長(zhǎng)15—30bp。引物的堿基序列3'端必須與模板正確配對(duì)，5'端可以不配對(duì)。引物的堿基組成盡可能提高G+C含量，以提高引物與模板的結(jié)合力避免連續(xù)相同堿基排列或內(nèi)部回文序列.避免形成引物二聚體(dimer)兩個(gè)引物之間不能有兩個(gè)以上的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)。引物的Tm值手工計(jì)算：Tm=(G+C)X4+(A+T)X2引物的濃度一般使用終濃度各0.5仇mol/L。簡(jiǎn)并引物如果引物的序列是從基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸序列反推出來(lái)的，就必須考慮密碼的簡(jiǎn)并性。需要合成多種序列的引物，彼此間只有一個(gè)或幾個(gè)堿基差異。這樣的混合引物稱(chēng)簡(jiǎn)并引物。套嵌引物(nestedprimers)設(shè)計(jì)多組引物，結(jié)合位點(diǎn)依次位于前一組引物之間。增加擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。(4)模板(template)①純度：PCR對(duì)模板DNA的純度要求不高。但不能有蛋白質(zhì)變性劑、DNA酶、Mg2+的螯合劑等影響DNA聚合酶的活性。②模板的量：不能太多，100^1反應(yīng)體系中l(wèi)OOng足夠。（5）dNTPsdNTPs是dATP、dTTP、dCTP和dGTP的總稱(chēng)。一般反應(yīng)體系中dNTP混合液終濃度用0.2mmo1/L。濃度過(guò)高會(huì)抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加錯(cuò)配率。（6）Mg2+的濃度所TaqDNA聚合酶要求有游離的Mg2+。以Mg2+濃度不能太低。但太高會(huì)增加非特異產(chǎn)物（雜帶）。一般用1.5-4.5mmo1/L的MgC12終濃度。PCR技術(shù)的擴(kuò)展（1）熒光實(shí)時(shí)定量PCR（2）反向PCR（3）不對(duì)稱(chēng)PCR用于擴(kuò)增單鏈DNA，單鏈DNA更適于測(cè)序。（4）反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）擴(kuò)增RNA模板。利用反轉(zhuǎn)錄酶，把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR技術(shù)的應(yīng)用（1）擴(kuò)增某一段DNA從基因組中擴(kuò)增；從載體上擴(kuò)增；組織樣本原位擴(kuò)增；微量殘留DNA擴(kuò)增；分析模板序列；（2）基因的體外誘變?cè)诨虻哪程幰牒塑账嵬蛔儯ㄈ笔?、重?fù)、插入、替換等）。利用引物的5'端序列不要求與模板嚴(yán)格配對(duì)，設(shè)計(jì)引物時(shí)引入突變序列。（3）基因組的比較研究比較不同物種之間的基因組特征和相似性。第五節(jié)DNA序列分析一、雙脫氧鏈終止法1.原理（1）DNA復(fù)制是以一條鏈為模板，按堿基配對(duì)的原則進(jìn)行的（3）復(fù)制反應(yīng)可以在體外進(jìn)行。（4）2'和3'雙脫氧的ddNTP會(huì)使復(fù)制反應(yīng)終止。2.技術(shù)要點(diǎn)。（2）脫氧核糖的連接是以3'-5'磷酸二脂鍵。（1）制備單鏈DNA模板，就是待測(cè)序的DNA鏈。（2）制備一小段單鏈引物（DNA或RNA）需帶有放射性或熒光標(biāo)記。（3）特殊的DNA多聚酶不能有5'-3'和3'-5'的外切酶活性；與模板的親和力高，不會(huì)提前脫離模板。(4)制備2'和3'雙脫氧的ddNTP3.Sanger雙脫氧終止法測(cè)序過(guò)程二、Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法1.原理末端放射性標(biāo)記DNA片單鏈用化學(xué)試劑處理，然后在特定的堿基中引入化學(xué)基團(tuán)，DNA在被修飾的核苷酸位置斷裂，形成長(zhǎng)度只差一個(gè)核苷酸的DNA鏈混合物，之后進(jìn)行凝膠電泳、放射性自顯影，就可以閱讀堿基順序。堿基特異的化學(xué)修飾法堿基特異的化學(xué)切割法測(cè)序過(guò)程每組反應(yīng)只針對(duì)特定的堿基，共有4組反應(yīng)，可分別顯示G、A+G、C、C+T的終止位置。特點(diǎn)：讀出的序列就是要測(cè)的序列。三、DNA雜交測(cè)序1.原理只有完全互補(bǔ)的DNA序列才能雜交形成完全的雙鏈分子。雜交效率高。有個(gè)別不互補(bǔ)堿基時(shí)，雜交效率下降。(3)非互補(bǔ)用一段寡居聚苷酸(8-mer)的所有可能的堿基排列序列作探針。根據(jù)雜交效率可推斷出靶DNA的序列堿基越多，雜交效率越差。2.技術(shù)要點(diǎn)DNA芯片(chip)把寡聚核苷酸探針的3‘端或5'端與玻璃或凝膠形成共價(jià)連接。四、DNA自動(dòng)化測(cè)序1.技術(shù)要點(diǎn)(1)非放射性標(biāo)記熒光物質(zhì)標(biāo)記。用激光能激發(fā)出不同顏色的熒光。(2)不同的標(biāo)記對(duì)象既可標(biāo)記引物，也可標(biāo)記ddNTP。反應(yīng)的自動(dòng)化Sanger脫氧終止法。讀片的自動(dòng)化激光探頭直接讀膠，實(shí)時(shí)閱讀。(4)分析自動(dòng)化電腦自動(dòng)把熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的堿基，并打印出DNA序列。(5)反應(yīng)可在一個(gè)試管中進(jìn)行標(biāo)記ddNTP時(shí)。熒光標(biāo)記引物的自動(dòng)化測(cè)序分別用4種熒光物標(biāo)記引物，區(qū)分反應(yīng)產(chǎn)物，混合電泳，激光一次讀膠，電腦合成結(jié)果。熒光標(biāo)記ddNTP自動(dòng)測(cè)序原理圖解第六節(jié)酵母雙雜交系統(tǒng)一、酵母雙雜交系統(tǒng)的作用有效地分離能與一種已知的靶蛋白相互作用的蛋白質(zhì)二、酵母雙雜交系統(tǒng)的原理結(jié)構(gòu)域(Domain)合作許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個(gè)在結(jié)構(gòu)上可以分開(kāi)的、功能上也相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成。拆開(kāi)Domain用重組DNA技術(shù)把GAL4的兩個(gè)Domain分開(kāi)，就喪失了激活效應(yīng)基因的能力。重組Domain用重組DNA技術(shù)把這兩個(gè)Domain分別與兩個(gè)不同的多肽連接。觀(guān)察報(bào)告基因表達(dá)通過(guò)效應(yīng)基因是否被激活來(lái)檢查：在體內(nèi)，蛋白A與蛋白B是否能結(jié)合。如果蛋白A與蛋白B不能相互結(jié)合GAL4的DBdomain與ADDomain也不能靠近，所以仍然不能啟動(dòng)效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。如果蛋白A與蛋白B能相互結(jié)合GAL4的DBdomain與ADDomain也能靠近，所以能啟動(dòng)效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。雙雜交原理X基因和Y基因產(chǎn)物的相互結(jié)產(chǎn)物的相互結(jié)合導(dǎo)致reportergenereportergene表達(dá)。Reportergene表達(dá)就可說(shuō)明X基因產(chǎn)物于Y基因產(chǎn)物能結(jié)合。三、構(gòu)建雙雜交體系的宿主菌刪除基因組中的內(nèi)源野生型GAL4基因使酵母菌只能利用載體表達(dá)的GAL4蛋白。四、構(gòu)建報(bào)告基因(reportergene)GAL4的效應(yīng)基因是his3/lacZ/URA3。五、構(gòu)建雙雜交體系的穿梭質(zhì)粒穿梭質(zhì)粒(shuttleplasmid)既能在大腸桿菌中復(fù)制，又能在酵母菌中復(fù)制和表達(dá)的質(zhì)粒。雙雜交體系需要兩種穿梭質(zhì)粒分別攜帶已知的靶蛋白基因和攜帶未知基因序列。(1)BD-plasmid靶基因按正確的讀碼結(jié)構(gòu)和取向克隆在GAL4的BD之后。(2)AD-plasmid外源基因按正確閱讀框克隆到GAL4的AD片斷之后。六、酵母雙雜交的實(shí)驗(yàn)過(guò)程把蛋白A插入到BD質(zhì)粒上(pGBT9)把蛋白B插入到AD質(zhì)粒上(pGAD424)兩種重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母菌(HF7c)篩選觀(guān)察(1)存活選擇(2)蛋白結(jié)合選擇第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶一、限制性核酸內(nèi)切酶(Restrictionendonuclease)是一類(lèi)能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列(4—8bp),并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。來(lái)源：原核生物。性質(zhì)：內(nèi)切酶，即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。功能：自我保護(hù)作用。(1)限制(Restriction)限制性?xún)?nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。(2)修飾(Modification)Dam甲基化酶Dcm甲基化酶二、限制性?xún)?nèi)切酶的類(lèi)型1.I型限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列：未甲基化修飾的特異序列。切割位點(diǎn)：在距離特異性識(shí)別位點(diǎn)約1000—1500bp處隨機(jī)切開(kāi)一條單鏈。作用機(jī)理：需ATP、Mg2+和SAM(S-腺苷蛋氨酸)。2.II類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列：未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列(多數(shù)是回文序列)。與DNA的來(lái)源無(wú)關(guān)。切割位點(diǎn)：切開(kāi)雙鏈DNA。形成粘性末端(stickyend)或平齊末端(bluntend)粘性末端(stickyends，cohensiveends)含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端。分兩種類(lèi)型：①5'端凸出(如EcoRI切點(diǎn))②3'端凸出(如PstI切點(diǎn))粘性末端的意義：①連接便利②5'末端標(biāo)記③補(bǔ)平成平齊末端(5)同裂酶(Isoschizomers)完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。不完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。同尾酶(Isocaudamers)識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。限制酶的酶活性：限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強(qiáng)度、pH等條件下才表現(xiàn)佳切割能力和位點(diǎn)的專(zhuān)一性。IIs型限制性?xún)?nèi)切酶：移動(dòng)切割(shiftedcleavage):在離它的不對(duì)稱(chēng)識(shí)別位點(diǎn)一側(cè)的特定距離處切割DNA雙鏈。3.III類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶在完全肯定的位點(diǎn)切割DNA，但反應(yīng)需要ATP、Mg2+和SAM(S-腺苷蛋氨酸)。三、限制性?xún)?nèi)切酶的命名用屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3個(gè)字母的略語(yǔ)表示寄主菌的物種名。2?用一個(gè)右下標(biāo)的大寫(xiě)字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR(現(xiàn)在都寫(xiě)成平行，如EcoRI)。如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示。如EcoRI，EcoRV。限制酶前面要帶上R(Restriction)，修飾酶前面要帶上M(Modification)。四、影響限制性?xún)?nèi)切酶活性的因素1.DNA的純度DNA的甲基化程度溫度緩沖液（Buffer）五、限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)DNA的消化內(nèi)切酶與識(shí)別序列的結(jié)合模式II類(lèi)限制酶是以同型二聚體的形式與靶序列結(jié)合。完全消化內(nèi)切酶在DNA上的所有識(shí)別位點(diǎn)都被切開(kāi)。局部消化只有有限數(shù)量的酶切位點(diǎn)被切開(kāi)。限制酶酶切反應(yīng)的終止大多數(shù)酶可用65°C溫育5分鐘失活。或用乙醇沉淀DNA。幾種常用限制酶識(shí)別位點(diǎn)限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列的交叉列表第二節(jié)DNA連接酶一、DNA連接酶（ligase）的發(fā)現(xiàn)從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測(cè)，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。二、DNAligase的特點(diǎn)兩種DNA連接酶（1）大腸桿菌連接酶：只能連接粘性末端。（2）T4噬菌體的連接酶：不但能連接粘性末端，還能連接齊平末端。連接條件（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3'端有游離的-0H,5'端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P）。（3）需要能量三、連接反應(yīng)的機(jī)理ATP（NAD+）提供激活的AMP。ATP與連接酶形成共價(jià)“連接酶-AMP”復(fù)合物，并釋放出焦磷酸PPi。AMP與連接酶的賴(lài)氨酸￡-氨基相連。AMP隨后從連接酶的賴(lài)氨酸￡-氨基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”復(fù)合物。3'-OH對(duì)磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出AMP。四、連接反應(yīng)的溫度最佳溫度：連接酶反應(yīng)的佳溫度是37°C。實(shí)用溫度：但在37C下粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定。所以一般采用4~16°C。五、影響連接反應(yīng)的因素插入片段與載體的濃度比例反應(yīng)溫度第三節(jié)DNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶KlenowfragmentT7DNA聚合酶T4DNA聚合酶5.修飾過(guò)的T7DNA聚合酶6.逆轉(zhuǎn)錄酶二、常用的DNA聚合酶的特點(diǎn)共同特點(diǎn)：把dNTPs連續(xù)地加到引物的3'—0H端。主要區(qū)別：持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。常用DNA聚合酶的特性比較：DNA聚合酶3'一5'外切酶活性5'-3'外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低無(wú)中低T4DNA聚合酶高無(wú)中低T7DNA聚合酶高無(wú)快高化學(xué)修飾T7DNA聚合酶低無(wú)快高遺傳修飾T7DNA聚合酶無(wú)無(wú)快高逆轉(zhuǎn)錄酶無(wú)無(wú)低中TaqDNA聚合酶無(wú)有快高三、DNA聚合酶在基因工程中的用途大腸桿菌DNA聚合酶I：主要用來(lái)制備帶放射性標(biāo)記的DNA探針。大腸桿菌DNA聚合酶I的性質(zhì)一條單鏈多肽。5'f3'外切酶活性位于外切酶活性位于NN端。用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉N端的5'-3'外切酶活性外切酶活性部分。就成為Klenowfragment。DNA聚合酶I(PolI)的反應(yīng)條件底物：dNTPs(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)Mg2+帶有3'—OH游離端的引物DNA模板(3)用DNA聚合酶I制備探針核酸探針(核酸探針(probeprobe)能夠同某種被研究的核酸序列特異性結(jié)合的，帶有標(biāo)記的寡聚核酸分子。探針的標(biāo)記方式DNADNA聚合酶聚合酶II對(duì)探針序列的標(biāo)記Klenowfragment(1)Klenowfragment的性質(zhì)具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切酶活性。(失去了5'-3'外切酶活性)。(2)主要用途3'端補(bǔ)平DNA3'末端標(biāo)記③cDNA第二鏈的合成T4DNA聚合酶（1）T4DNA聚合酶的性質(zhì)來(lái)源：從T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化。由噬菌體基因43編碼。酶活性：有5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切酶活性（降解單鏈更快）。特點(diǎn)：當(dāng)沒(méi)有dNTP時(shí)，T4DNA聚合酶行使3'-5'外切酶功能，制造出3'隱蔽端。（2）T4DNA聚合酶的用途補(bǔ)平隱蔽末端②DNA3'末端標(biāo)記放射性標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：制作簡(jiǎn)單、高比放射性、放射自顯影效果好。缺點(diǎn)：半衰期短（32P只有14.3天）、不易保存、對(duì)人體有害。要求在專(zhuān)門(mén)實(shí)驗(yàn)室操作。非放射性標(biāo)記i）生物素標(biāo)記ii）地高辛標(biāo)記iii）偶聯(lián)酶及其底物常用的兩種酶：辣根過(guò)氧化物酶（horseradishperoxidase，HRPO）堿性磷酸酶（AlkalinePhosphatase,AP）酶的作用：催化一些特殊的反應(yīng)，反應(yīng)的過(guò)程中發(fā)出熒光（或生成有色的產(chǎn)物）。iv）用非放射性標(biāo)記的探針檢測(cè)原理探針DNA用生物素或地高辛標(biāo)記。親和素或地高辛抗體與酶偶聯(lián)。酶催化一個(gè)發(fā)光或顯色反應(yīng)。親和素或地高辛抗體與生物素或地高辛結(jié)合。核酸探針雜交篩選法的缺點(diǎn)是：只檢測(cè)是否有外源DNA插入，而不論該DNA是否表達(dá)出產(chǎn)物。T7DNA聚合酶（1）來(lái)源：從T7噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞中純化出來(lái)的。（2）T7DNA聚合酶的特點(diǎn)持續(xù)合成能力強(qiáng)3'-5'外切酶活性高不受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響（3）T7DNA聚合酶的用途以大分子量DNA為模板的合成進(jìn)行末端標(biāo)記補(bǔ)平隱蔽末端修飾后的T7DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化學(xué)修飾去除3'-5'外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修飾后的T7DNA聚合酶的用途DNA測(cè)序雙脫氧法。標(biāo)記DNA3'隱蔽末端更有效地補(bǔ)平末端6.逆轉(zhuǎn)錄酶依賴(lài)RNA的DNA聚合酶(RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶)。來(lái)源：RNA腫瘤病毒。(2)AMV的性質(zhì)a鏈有反轉(zhuǎn)錄活性和RNaseH活性。P鏈RNA-DNA雜交雙鏈中5'~3'DNA外切酶活性。逆轉(zhuǎn)錄酶的用途合成cDNA合成DNA探針RT-PCR用的模板第四節(jié)DNA修飾酶一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶來(lái)源：小牛胸腺。組成：大小兩個(gè)亞基。特性:需要3'—OH、二甲胂酸緩沖液。不需要模板！底物可以是單鏈DNA、是3'—OH突出的雙鏈DNA、平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。隨機(jī)添加的dNTPs。如果只有一種dNTP，就添加上同聚物。末端轉(zhuǎn)移酶的用途同聚物加尾給外源DNA片斷和載體分子分別加上互補(bǔ)的同聚物尾巴，以使它們有效地連接。(2)再生酶切位點(diǎn)，便于回收克隆片斷。非放射性標(biāo)記DNA片斷的3'端催化非放射性標(biāo)記物參入DNA片斷的3'端。(生物素-11-dUTP等)二、T4多核苷酸激酶來(lái)源T4噬菌體的pseT基因編碼。從T4感染大腸桿菌細(xì)胞中分離出來(lái)。多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)這種酶。功能催化Y磷酸從ATP轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5'-OH端。多核苷酸激酶的用途DNA5'-OH端磷酸化標(biāo)記DNA的5'端三、堿性磷酸酶堿性磷酸酶種類(lèi)(1)細(xì)菌性堿性磷酸酶(2)小牛腸堿性磷酸酶堿性磷酸酶的特性催化脫掉DNA(或RNA)5'端的磷酸根。堿性磷酸酶的功能防止線(xiàn)性化的載體份子自我連接第五節(jié)核酸外切酶(Exonucleases)是一類(lèi)從多核苷酸鏈的一頭開(kāi)始催化降解核苷酸的酶。一、單鏈DNA外切酶大腸桿菌核酸外切酶I(exoI)5'~3'外切(識(shí)別5'-OH)大腸桿菌核酸外切酶W(exoW)5'~3'、3'-5'外切(識(shí)別3'-0H、5'-P)二、雙鏈DNA外切酶核酸外切酶111(exoIII)3'-5'外切(識(shí)別3'-OH)主要用途：在DNA雙鏈的末端產(chǎn)生出單鏈區(qū)域。入核酸外切酶(入exo)5'~3'外切，識(shí)別5'-P(但不能降解5'-OH)主要用途：使DNA雙鏈變成單鏈(短)3.T7基因6核酸外切酶5'~3'外切。既能識(shí)別5'-P,又能識(shí)別5'-OH。用途與入exo一樣。第六節(jié)單鏈DNA內(nèi)切酶一、S1核酸酶來(lái)源:稻谷曲霉(Aspergillusoryzae)。特性(1)高度單鏈特異性(2)反應(yīng)條件①低水平Zn2+②pH4.0?4.3S1核酸內(nèi)切酶的功能(1)催化單鏈RNA或DNA降解。切掉雙鏈核酸中的單鏈區(qū)。降解限制酶切形成的單鏈突出端。不能降解雙鏈DNA或RNA-DNA雜交鏈.S1核酸酶的用途(1)定位RNA用mRNA測(cè)定基因中的外顯子序列二、Bal31核酸酶來(lái)源:埃氏交替單胞菌(Alteromonoasespejiana)功能:既有單鏈特異的DNA(RNA)內(nèi)切酶；又有雙鏈特異的DNA外切酶。反應(yīng)條件:Mg2+、Ca2+Bal31的用途:定位測(cè)定DNA片斷中的限制酶位點(diǎn)分布。Bal31控制消化法:用Bal31消化線(xiàn)性DNA，并在不同的時(shí)間加入EGTA終止反應(yīng)，再酶切電泳。與對(duì)照組(不用Bal31消化)只用相同的酶切的電泳比較。根據(jù)酶切片斷消失的先后順序，判斷這些片斷在原DNA中的位置。分別用各個(gè)內(nèi)切酶切后電泳，記錄片斷數(shù)目和大小。分別用原內(nèi)切酶切后電泳，判斷片斷數(shù)目和大小。第三章第三章基因工程載體載體(Vectors)：在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子叫載體。基因工程對(duì)載體的要求在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立復(fù)制。(2)有選擇性標(biāo)記。(3)有一段多克隆位點(diǎn)。(4)分子量小，拷貝數(shù)多。(5)容易從宿主細(xì)胞中分離純化。載體的種類(lèi)質(zhì)粒(plasmid)單鏈DNA噬菌體M13久噬菌體的衍生物柯斯質(zhì)粒(cosmid)動(dòng)物病毒(virus)第一節(jié)質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒(plasmid)是獨(dú)立于染色體以外的能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性分子小：1—200kb編碼基因少：2—3個(gè)中等大小的蛋白質(zhì)。(3)環(huán)形狀：雙鏈環(huán)狀DNA。(4)質(zhì)粒的空間構(gòu)型：共價(jià)閉合開(kāi)環(huán)DNA(opencircular，ocDNA)線(xiàn)形DNA(linear，lDNA)(5)質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：scDNA快、1DNA次之、ocDNA慢。二、質(zhì)粒的類(lèi)型接合型質(zhì)粒:能自我轉(zhuǎn)移非接合型質(zhì)粒：不能自我轉(zhuǎn)移接合型質(zhì)粒：又叫自我轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒。除了帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。非接合型質(zhì)粒：雖然帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息，但失去了控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因，因此不能從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。R質(zhì)粒(抗性質(zhì)粒)：帶有一種或數(shù)種抗生素抗性基因，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀(resistance)。Col質(zhì)粒：帶有控制大腸桿菌素(colicin)合成的基因。三、質(zhì)粒的復(fù)制類(lèi)型嚴(yán)緊型質(zhì)粒(stringentplasmid)拷貝數(shù)少，只有1—3份拷貝。松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid)拷貝數(shù)多，有10—60份拷貝。四、質(zhì)粒載體的構(gòu)建天然質(zhì)粒的局限性(1)分子量大，拷貝數(shù)低(2)篩選標(biāo)志不理想質(zhì)粒載體必須具備的基本條件(1)具有復(fù)制起點(diǎn)(ORI)(2)具有抗菌素抗性基因若干限制性?xún)?nèi)切酶的單一位點(diǎn)具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。質(zhì)粒的選擇標(biāo)記及其工作原理：(1)選擇標(biāo)記抗菌素抗性氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)抑菌原理：通過(guò)干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成的末端反應(yīng)，殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌。細(xì)菌抗性原理：Ampr基因編碼0-內(nèi)酰胺酶，特異地切割氨芐青霉素的0-內(nèi)酰胺環(huán)。氯霉素()氯霉素(cchlorahlorammphenicophenicoll，，CmlCml))a)抑菌原理：通過(guò)與50S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌生長(zhǎng)的細(xì)菌。b)細(xì)菌抗性原理：Cmlr編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶，特異地使氯霉素乙酰化而失活。卡那霉素(kankanamycinamycin，，KanKan)殺菌原理：通過(guò)與70S核糖體結(jié)合，導(dǎo)致mRNA發(fā)生錯(cuò)讀。殺死細(xì)菌。細(xì)菌抗性原理：Kanr編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，對(duì)卡那霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體結(jié)合作用。Iv)鏈霉素(StrStreptomycineptomycin，，StrStr)殺菌原理：通過(guò)與30S核糖體亞基結(jié)合，導(dǎo)致mRNA錯(cuò)譯。殺死細(xì)菌。細(xì)菌抗性原理：Strr編碼一種氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶對(duì)鏈霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體30S亞基結(jié)合作用。v)四環(huán)素(TetTetracyclineracycline，TetTet))抑菌原理：通過(guò)于30S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌。細(xì)菌抗性原理：Tetr編碼特異性蛋白質(zhì)，對(duì)細(xì)菌的膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，組止四環(huán)素通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。遺傳標(biāo)記使受體菌發(fā)生遺傳性狀的改變的基因?？咕剡x擇原理不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能在含有抗菌素的培養(yǎng)基(選擇培養(yǎng)基)中生長(zhǎng)。當(dāng)帶有抗菌素抗性基因的載體進(jìn)入受體菌后，受體菌才能生長(zhǎng)。人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體的類(lèi)型（1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體（2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體（3）失控的質(zhì)粒載體runawayplasmidvectors（4）插入失活型質(zhì)粒載體（5）正選擇的質(zhì)粒載體Directselectionvectors（6）表達(dá)型質(zhì)粒載體表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)1）普通載體元件復(fù)制起始點(diǎn)ORI選擇標(biāo)記多克隆位點(diǎn)MCS2）大腸桿菌操縱子元件阻遏基因I操縱基因O啟動(dòng)基因P核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD）轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)區(qū)五、經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體pSC101第一個(gè)成功地用于克隆實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。（1）類(lèi)型：天然質(zhì)粒，屬低拷貝型。（2）長(zhǎng)度：9.09kb。（3）選擇標(biāo)記：四環(huán)素抗性Tetr（4）克隆位點(diǎn)：6個(gè)克隆位點(diǎn)：EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI（主要使用EcoRI）ColE1（1）類(lèi)型：天然質(zhì)粒，屬高拷貝型。（2）長(zhǎng)度：6.3kb。（3）選擇標(biāo)記：大腸桿菌素（colicin）E和對(duì)El、免疫的基因（immEl）（4）克隆位點(diǎn)：EcoRI（5）ColEl的選擇缺陷用對(duì)外源colicinEl的免疫性和自身不能合成colicinEl作選擇，操作非常繁雜。對(duì)colicinEl敏感的細(xì)菌群體中自發(fā)突變產(chǎn)生抗colicinEl的頻率很高！pBR322：F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工構(gòu)建載體。（1）元件來(lái)源復(fù)制起點(diǎn)ori：pMBl系列（來(lái)源于ColEl）的高拷貝型復(fù)制起點(diǎn)Ampr基因：pSP2124質(zhì)粒的Ampr基因Tetr基因：pSC101的Tetr基因（2）長(zhǎng)度：4363bp（3）選擇標(biāo)記：氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。（4）克隆位點(diǎn)：24個(gè)克隆位點(diǎn)。（5）pBR322的優(yōu)點(diǎn)雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記分子小，克隆能力大高拷貝數(shù)安全（6）pBR322pBR322的缺點(diǎn)保留了轉(zhuǎn)移蛋白（mob）的作用位點(diǎn)。能夠被ColK質(zhì)粒編碼的mob蛋白識(shí)別，如果再有F質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移?。?）PBR322的改進(jìn)刪除mob識(shí)別位點(diǎn)改造EcoRI位點(diǎn)pUCpUC系列：UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體。（1）元件來(lái)源復(fù)制起點(diǎn)：pBR322的oriAmpr基因：pBR322的Ampr基因（但其上失去了克隆位點(diǎn)）lacZ的啟動(dòng)子：大腸桿菌lacZ'基因：大腸桿菌lacZ的a-肽鏈序列，是LacZ的氨基端片斷。（2）長(zhǎng)度：約2.7kb（3）克隆位：10個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于lacZ'基因的5'端。（4）選擇標(biāo)記Ampicillin抗性和lacZ的a肽互補(bǔ)（藍(lán)白斑）相結(jié)合。（5）pUCpUC系列載體的優(yōu)點(diǎn)系列載體的優(yōu)點(diǎn)更小的分子量選擇方便克隆便利測(cè)序方便六、其它質(zhì)粒載體pGEM-3Z:由pUC派生而來(lái)。PGEM-3Z的特點(diǎn)：如果加入純化的T7或SP6RNA聚合酶，在試管里就可以轉(zhuǎn)錄mRNA外源基因正接反接都可以轉(zhuǎn)錄。MCS與pUC18的完全一樣。pGEM-4Z：與pGEM-3Z相同，只是T7啟動(dòng)子和SP6啟動(dòng)子的位置互換。穿梭質(zhì)粒載體（shuttleplasmidvectorsshuttleplasmidvectors）（1）穿梭質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。（2）常用的穿梭質(zhì)粒載體大腸桿菌一枯草桿菌穿梭載體大腸桿菌—釀酒酵母穿梭載體大腸桿菌f動(dòng)物細(xì)胞穿梭載體（3）穿梭載體的優(yōu)點(diǎn)利用大腸桿菌進(jìn)行基因克隆、表達(dá)也能利用其它細(xì)胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等）進(jìn)行基因表達(dá)?？梢宰匀绲卦趦煞N不同寄主細(xì)胞之間來(lái)回轉(zhuǎn)移基因。七、質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個(gè)條件：（1）每個(gè)世代、每個(gè)質(zhì)粒至少要復(fù)制一次（2）在細(xì)胞分裂時(shí)，復(fù)制過(guò)的質(zhì)粒必須分配到兩個(gè)子細(xì)胞中。質(zhì)粒分配方式（1）主動(dòng)分配：天然質(zhì)粒（2）隨機(jī)分配：人工質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性（segregationinstability）在寄主菌細(xì)胞分裂的過(guò)程中，有一個(gè)細(xì)胞沒(méi)有獲得質(zhì)?？截悾⒔K繁殖成無(wú)質(zhì)粒的優(yōu)勢(shì)群體。結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性（structuralinstability）寄主基因組的IS序列插入質(zhì)粒、質(zhì)粒間的同源重組等都會(huì)使質(zhì)粒發(fā)生插入或缺失。影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素（1）新陳代謝負(fù)荷：復(fù)制負(fù)荷轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)荷（2）質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)是產(chǎn)生無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞的重要原因。（3）寄主菌的重組體系含有大分子量插入片斷的質(zhì)粒載體普遍能形成質(zhì)粒寡聚體。第二節(jié)噬菌體載體一、噬菌體的一般特性噬菌體是一類(lèi)細(xì)菌病毒（Bacteriophage）。結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)外殼內(nèi)包裹著DNA（雙鏈、單鏈、線(xiàn)性、環(huán)狀等）。二、噬菌體的生活周期溶菌周期：烈性噬菌體（virulentphage）感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。溶原周期：溫和噬菌體（temperatephage）感染細(xì)菌后，將自己的DNA整合到細(xì)菌的染色體DNA中。形成這一過(guò)程稱(chēng)為溶源化（lysogenization）。整合到細(xì)菌染色體的噬菌體DNA稱(chēng)為原噬菌體，隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。三、單鏈?zhǔn)删w載體單鏈環(huán)狀DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體：M13、fd1、fd噬菌體單鏈DNA噬菌體的特點(diǎn)（1）+DNA。（ssDNA）（2）復(fù)制型（RF）是雙鏈環(huán)狀DNA。（3）RFDNA和ssDNA都能轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌。并產(chǎn)生噬菌斑。（4）不存在包裝限制。（5）可產(chǎn)生大量的含有外源DNA插入片斷的單鏈分子，便于作探針或測(cè)序。M13噬菌體（1）寄主：M13噬菌體只感染雄性大腸桿菌。但M13DNA可以轉(zhuǎn)染雌性大腸桿菌。(2)DNA長(zhǎng)度：6407bp。DNA提純：RFdsDNA在寄主細(xì)胞內(nèi)以高拷貝形式存在。成熟的噬菌體里只包裝有+DNA，也容易提取。(4)M13的生活周期M13通過(guò)雄性細(xì)菌的F性須注入其+DNA-+DNA合成一DNA,形成RFdsDNAf—DNA轉(zhuǎn)錄mRNA、合成+DNA、翻譯形成噬菌體蛋白一組裝成新的噬菌體M13，擠出寄主細(xì)胞(5)沒(méi)有包裝限制M13載體的構(gòu)建：克隆區(qū)域的選定(2)加入酶切位點(diǎn)(3)M13載體系列M13載體系列的命名對(duì)M13mp1的改進(jìn)對(duì)M13mp2的進(jìn)一步改進(jìn)M13系列載體的優(yōu)點(diǎn)有MCS，便于克隆不同的酶切片段Xgal顯色反應(yīng)，可供直接選擇無(wú)包裝限制，克隆能力大可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈M13載體的缺點(diǎn)插入外源DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降實(shí)際克隆能力小于1500bp。噬菌粒載體(phagemidphagemidvectorsvectors)由質(zhì)粒載體與單鏈?zhǔn)删w載體的復(fù)制起點(diǎn)結(jié)合而成的新型載體系列。噬菌粒載體的特點(diǎn)分子量小克隆能力大兩種復(fù)制形式既具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，又具有噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)。(3)pUC118/pUC119構(gòu)成1)M13的基因間隔區(qū)(IG)帶有M13復(fù)制起點(diǎn)。2)pUC18/pUC19質(zhì)粒載體：質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)AmprlacZ'MCSpUC118/119的復(fù)制模式雙鏈質(zhì)粒復(fù)制模式單鏈滾環(huán)噬菌體復(fù)制模式噬菌粒載體的包裝(4)pBluescript噬菌粒載體(pBS)組成由pUC質(zhì)粒載體、f1噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)和T3、T7噬菌體的啟動(dòng)子組成。②特點(diǎn)1）定向體外轉(zhuǎn)錄MCS兩側(cè)分別加上T3和T7噬菌體的啟動(dòng)子。加入適當(dāng)?shù)氖删wRNA聚合酶，就可以定向體外轉(zhuǎn)錄。2）兩種復(fù)制模式既能以質(zhì)粒的形式復(fù)制，又能以噬菌體的形式復(fù)制包裝。3）選擇方便有Ampr和lacZ',可以進(jìn)行Amp抗性選擇和Xgal-IPTG藍(lán)白斑選擇。4）插入方便18個(gè)單一酶切位點(diǎn)的MCS③常用的pBluescript載體（5）PCR產(chǎn)物克隆載體T載體結(jié)構(gòu)：pUC的質(zhì)粒部分、fi噬菌體ori、Kanr和Ampr抗性。特點(diǎn)：MCS的中部已經(jīng)切開(kāi)，各有一個(gè)3'端突出T。噬菌體展示載體（Phagedisplayvector）（1）噬菌體展示（Phagedisplay）將外源蛋白（多肽、酶、抗體、DNA結(jié)合蛋白）結(jié)合到噬菌體的外殼蛋白上形成融合蛋白，表達(dá)于噬菌體的外表面。（2）噬菌體展示載體的構(gòu)建把外源DNA片斷插入基因III的序列前端，并保持兩者的閱讀框正確，表達(dá)出融合蛋白。四、雙鏈?zhǔn)删w載體一入載體入DNA分子的特點(diǎn)（1）長(zhǎng)度為48502bp；（2）雙鏈線(xiàn)性DNA；（3）但在兩端有cos位點(diǎn)，可以環(huán)化。入噬菌體的基因組特點(diǎn)入DNA上有至少61個(gè)基因，有一半是必須的，與自身的活動(dòng)有關(guān)，成簇排列。其他約1/3是非必須基因（位于尾部合成至阻遏之間的區(qū)段）。入DNA的復(fù)制模型（1）0型復(fù)制（2）滾環(huán)復(fù)制入噬菌體載體的構(gòu)建（1）構(gòu)建原理：刪除入噬菌體的非必需區(qū)，留出插入空間。（2）構(gòu)建過(guò)程在這個(gè)非必須區(qū)內(nèi)制造限制酶切點(diǎn)引進(jìn)某些突變表型，作為選擇標(biāo)記突變某些基因，使它成為安全載體刪除入DNA必須區(qū)段上常用的限制酶切點(diǎn)（3）人工構(gòu)建的入噬菌體載體有兩種類(lèi)型：①插入型載體（insertionvectors）②替換型載體(substitutionvectors)入載體的篩選標(biāo)記置換型載體可取代片斷中如果包含LacZ'可用Xgal顯色作篩選標(biāo)記。插入型載體根據(jù)插入所引起的表型突變。入載體的體外包裝(1)體外包裝：在試管中與入噬菌體的頭部和尾部蛋白人工裝配成噬菌體顆粒，才能高效地感染細(xì)菌，把重組DNA注入受體菌中。(2)體外包裝過(guò)程入噬菌體外殼蛋白的合成E基因：入的E基因編碼頭部蛋白的主要成分(占頭部總蛋白的70%)。D基因：入的D基因的產(chǎn)物也是頭部蛋白，但主要與入DNA進(jìn)入頭部和頭部的成熟有關(guān)(只占20%)。體外包裝存在的問(wèn)題包裝錯(cuò)誤重組體外包裝的容量限制入DNA載體的優(yōu)點(diǎn)比一般的質(zhì)粒載體的容量大的多。cosmidcosmid載體(粘粒)(1)大?。?-6kb(2)組成入DNA：cos序列和控制包裝的的序列。PBR322:質(zhì)粒的復(fù)制子、抗藥性基因、幾個(gè)限制性酶的單一位點(diǎn)(3)cosmidvector的特點(diǎn)具有入噬菌體的特性具有質(zhì)粒載體的特性方便的選擇高容量的克隆能力(5)cosmidcloning應(yīng)用cosmid載體在大腸桿菌中克隆大片端的真核基因組DNA技術(shù)，叫“柯斯克隆"(cosmidcloning)。①理論依據(jù)：cos位點(diǎn):：包裝識(shí)別。“多聯(lián)體”復(fù)制：入噬菌體的生命周期中，會(huì)產(chǎn)生數(shù)百個(gè)入DNA通過(guò)cos位點(diǎn)連接的“多聯(lián)體”分子。Ter體系：在包裝的時(shí)候，入噬菌體具有位點(diǎn)特異的末端酶(terminase)體系(Ter體系)，識(shí)別cos位點(diǎn)，把多聯(lián)體切成單個(gè)入DNA長(zhǎng)度。包裝限制：兩個(gè)cos位點(diǎn)之間，必須保持38—45kb的DNA，Ter體系才能識(shí)另I」。(6)cosmid克