克隆形成實驗細胞生長狀況有關(guān)指標的檢測方法

一、細胞計數(shù)

這是細胞培養(yǎng)中常用的基本技術(shù)之一。所用材料為血球計數(shù)板，巴氏吸管和顯微鏡。

細胞計數(shù)的基本步驟：

(1)取清潔計數(shù)板和專用蓋玻片，用絲綢布輕輕拭干.

(2)取細胞懸液0.3mL，加入0.9mL結(jié)晶紫(或臺盼至)染液，混勻后滴半滴于血球計數(shù)板內(nèi)，以充滿不外溢為宜。也可直接將細胞懸液在一側(cè)滴加到蓋玻片中，不要溢出，也不要過少或出現(xiàn)氣泡.

(3)在顯微鏡下用10×物鏡觀察計數(shù)四角大分格中的細胞數(shù)。代入下式得出細胞密度。

細胞數(shù)/ml=(4大格細胞數(shù)之和/4)×104×稀釋倍數(shù)

臺盼藍染色法可計算出活細胞數(shù)和死細胞數(shù)以測定細胞存活百分率。一般0.5%～1%的臺盼藍染液可使死細胞染成藍色，活細胞不著色。此外還可用0.02%的藻紅B染液將死細胞或受損細胞染成紅色，或用0.05%的苯胺黑染液將死細胞染成黑色。

細胞存活百分率=（4大格活細胞數(shù)/4大格活細胞+死細胞數(shù)）×100%

細胞計數(shù)除用上述方法外，目前還有新型的自動計數(shù)儀，可供大規(guī)模細胞計數(shù)工作使用。各種型號的計數(shù)操作不盡相同，可根據(jù)使用說明進行操作。

在進行細胞計數(shù)操作時，必須把細胞懸液準備好，細胞應(yīng)分散良好，并充分混勻，若出現(xiàn)較多細胞團或細胞數(shù)少于200個/10mm2或多于500個/10mm2時，需重制細胞懸液，重新計數(shù)。

二、細胞生長曲線和生長倍數(shù)

細胞生長曲線是細胞培養(yǎng)實驗中最基本的指標，是測定細胞絕對增長數(shù)值和生長繁殖基本規(guī)律常用的簡便方法。常用的方法為：在同一規(guī)格的培養(yǎng)瓶中，接種同等量的同一代細胞，經(jīng)培養(yǎng)后每隔24小時取出幾瓶細胞進行計數(shù)，以培養(yǎng)時間為橫座標，不同時刻的細胞數(shù)的對數(shù)為底座標，標出各點并連成線，即為該細胞的生長曲線，可反應(yīng)出細胞生長的動態(tài)。

測定生長曲線的另一種方法是用96孔/24孔細胞培養(yǎng)板，分7組，每組3孔，培養(yǎng)一周(7天)，期間逐日檢測一組，計數(shù)，最后把7天中的細胞數(shù)值繪成圖，即為細胞生長曲線。

也可采用MTT法來進行生長曲線測定，較上述方法簡便。

標準的細胞生長曲線近似“S”形，一般在傳代后第一天細胞數(shù)有所減少，經(jīng)過一段時間的潛伏期，再進入對數(shù)生長期，達到平臺期和生長穩(wěn)定，最后衰老。

細胞生長倍數(shù)是指測定接種時活細胞的濃度，經(jīng)一個生長周期達到最大活細胞濃度的比率。

生長倍數(shù)=培養(yǎng)后最大活細胞濃度/接種時的活細胞濃度

三、細胞分裂指數(shù)

細胞分裂指數(shù)是表示細胞增殖旺盛程度的指標。它以被測1000個細胞中的分裂細胞數(shù)來計算。其方法為：用秋水仙素將細胞處理1～2小時后，按染色體制片法制片并染色，計算1000個細胞中分裂相的數(shù)目，重復(fù)4次取平均值，用百分比表示。

基本步驟：

(1)細胞準備

用蓋片(支持物)培養(yǎng)法。

(2)每24小時取出一個小玻片，按常規(guī)方法進行固定，吉姆薩或HE染色，封片，制成永久標本。

(3)顯微鏡下選擇細胞密度適中的區(qū)域觀察分裂細胞并計數(shù)。逐個視野進行，對每一時間組的玻片各取細胞多、中、少3個區(qū)域各一區(qū)，共數(shù)1000個細胞，計算出平均分裂相值所占百分比。觀察時要掌握好