生物被膜鑒定方法的研究進(jìn)展

在自然環(huán)境中，細(xì)菌通常以游泳和固體的形式存在。傳統(tǒng)上,所有生態(tài)系統(tǒng)中的微生物有組織地生長的聚集體叫細(xì)菌生物被膜(bacterialbiofilm)?，F(xiàn)在認(rèn)為,細(xì)菌生物被膜是指細(xì)菌附著于惰性或者活性實體的表面,繁殖、分化并分泌一些多糖基質(zhì),將菌體群落包裹其中而形成的細(xì)菌聚集體膜狀物。任何細(xì)菌在一定條件下都可以形成生物被膜,生物被膜是微生物的王國,單個生物被膜可由同種或不同種微生物形成。一直以來,對于細(xì)菌生物被膜的研究重點是細(xì)菌如何黏附到物體表面,如何形成生物被膜,形成生物被膜后細(xì)菌的分散方式等,而對于其鑒定方法卻尚未做全面闡述,故筆者擬對幾種常見的生物被膜鑒定方法作一簡單綜述,為細(xì)菌生物被膜的進(jìn)一步研究提供參考。1生物被膜的觀察細(xì)菌首先形成微小菌落,然后逐漸被分泌的黏多糖包繞形成生物被膜,肉眼不易直接觀察,需通過染色、放大等處理后才能對生物被膜進(jìn)行觀察。從目前的研究情況來看,常見的生物被膜鑒定方法主要有以下幾種。1.1生物被膜的制備方法試管法(glasstubemethod)是一種簡單、快捷、所需試劑和儀器等試驗條件較低的一種生物被膜鑒定方法,被廣泛運用于生物被膜的初步定性檢測。主要試劑和儀器:培養(yǎng)基、玻璃試管、37℃恒溫振蕩器、烘箱、超凈工作臺和結(jié)晶紫染料等。主要操作步驟:①挑取待檢單克隆菌株接種于培養(yǎng)液里37℃振蕩培養(yǎng)過夜;②轉(zhuǎn)接20μL過夜培養(yǎng)物加入裝有2mL培養(yǎng)液的硼硅酸鹽玻璃試管中;③在37℃恒溫振蕩器上以150r/min培養(yǎng)12~16h;④用注射器將試管中的培養(yǎng)液吸取后,加入2.5mL的10g/LHucker結(jié)晶紫,室溫孵育5min;⑤吸取試管中多余的結(jié)晶紫染色液后,在自來水下沖洗試管3~5min;⑥把試管倒置在濾紙上除去過多的水,并在37℃烘箱中烘干,觀察、記錄。設(shè)置空白對照。2009年,達(dá)來寶力格等用試管法對胸膜肺炎放線桿菌(APP)的15個血清型國際參考菌株和22個中國地方分離菌株在體外形成生物被膜的能力進(jìn)行了定性分析,結(jié)合微量板定量檢測法檢測結(jié)果,得出大多數(shù)血清型的胸膜肺炎放線桿菌能在體外形成生物被膜,尤其在地方分離株中更普遍;與低毒力血清型的菌株相比,高毒力和中等毒力血清型的菌株更傾向于形成生物被膜的結(jié)論。2009年,Li等運用試管法鑒定了從污水處理系統(tǒng)和土壤中分離的18個菌株的生物被膜形成能力,同時評價了胞外多糖、鞭毛、N?；z氨酸內(nèi)酯信號分子、胞外蛋白和蜂擁運動等五個因素對細(xì)菌生物被膜形成能力的影響情況。由于受肉眼觀察和結(jié)果判定存在主觀差異的局限性,試管鑒定法對生物被膜微觀形態(tài)的觀察并不理想。此方法只能初步鑒定細(xì)菌是否具有生物被膜形成能力,不適合用于生物被膜的深層研究。但是如果需要大批量地檢測細(xì)菌是否具有生物被膜形成能力,試管法是一個不錯的選擇。1.2硝酸銀溶液法銀染法(silverstainingmethod)是通過對生物被膜進(jìn)行銀染后,用普通光學(xué)顯微鏡對著色后的生物被膜進(jìn)行觀察的鑒定方法。它比采用電鏡和激光共聚焦顯微鏡鑒定法的試驗費用相對便宜,儀器要求也相對較低。主要試劑和儀器:硝酸銀、氯化鈣、對苯二酚、硫代硫酸鈉、250mL/L戊二醛、顯微照相系統(tǒng)和普通光學(xué)顯微鏡等。主要操作步驟:①將制作好的待測生物被膜經(jīng)滅菌生理鹽水多次充分漂洗,去掉浮游菌;②250mL/L戊二醛PBS溶液中固定1h;③蒸餾水清洗1min;④飽和氯化鈣溶液結(jié)合15min;⑤蒸餾水清洗15min;⑥50g/L硝酸銀溶液反應(yīng)15min;⑦10mL/L對苯二酚溶液顯色2min;⑧蒸餾水漂洗1min;⑨50g/L硫代硫酸鈉溶液固定2min;⑩蒸餾水漂洗1min。銀染后用普通光學(xué)顯微鏡觀察。注意事項:①試劑配制后不宜放置時間過長,否則硝酸銀沉淀影響觀察結(jié)果;②硝酸銀溶液配制后需過濾,以免影響染色效果;③漂洗力度適中,既不能破壞生物被膜,又要漂洗干凈;④染色后需及時觀察,設(shè)置空白對照。2007年,孔晉亮等分別用銀染法和掃描電鏡(scanningelectronmicroscope,SEM)法對銅綠假單胞菌生物被膜進(jìn)行了研究,銀染后用普通光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡對生物被膜變化的觀察結(jié)果完全相符,并且認(rèn)為用銀染法觀察細(xì)菌生物被膜的變化操作便捷、結(jié)果可靠。2009年,佟金平等分別用銀染法和掃描電鏡法觀察葡萄球菌的生物被膜,探討了銀染法觀察生物被膜的可靠性,得出銀染后普通光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察生物被膜結(jié)果完全相符的結(jié)論。臨床上治療細(xì)菌生物被膜相關(guān)感染時,常需反復(fù)觀察藥物對細(xì)菌生物被膜的清除情況。目前細(xì)菌生物被膜變化情況的鑒定方法有掃描電鏡、透射電鏡(transmissionelectronmicroscope,TEM)和激光共聚焦掃描顯微鏡等方法,但是在一般級別的醫(yī)院及科研院所都不具有這些儀器,且存在操作繁瑣、費用昂貴的缺點,難以普及。銀染法用于觀察生物被膜敏感性強(qiáng),而且操作簡便,價格低廉,可用于實驗室常規(guī)操作,適宜臨床推廣。但是,在銀染的過程中生物被膜會受到銀染試劑不同程度的影響,其結(jié)構(gòu)形態(tài)會發(fā)生不同程度的改變;另外,銀染法也只能初步觀察細(xì)菌生物被膜的外層結(jié)構(gòu),無法對被膜內(nèi)層結(jié)構(gòu)和生理學(xué)現(xiàn)象進(jìn)行觀察。1.3生物被膜的檢測電鏡由電子光學(xué)技術(shù)、真空技術(shù)、精細(xì)機(jī)械結(jié)構(gòu)和現(xiàn)代計算機(jī)控制技術(shù)等組成。在加速高壓作用下,由電子槍發(fā)射的電子經(jīng)電子光學(xué)系統(tǒng)聚集成束照射到樣品表面,對樣品進(jìn)行逐行掃描,經(jīng)顯示器顯示成直觀的圖像信息。主要試劑和儀器:PBS緩沖液、25mL/L戊二醛(pH7.4)、10mL/L鋨酸、醋酸正戊酯、丙酮、醋酸鈾、枸櫞酸鉛、618環(huán)氧樹脂包埋液、超薄切片機(jī)、CO2臨界點干燥儀、離子濺射儀、透射電鏡、掃描電鏡。SEM標(biāo)本制備的主要步驟:①用25mL/L的戊二醛溶液于4℃固定24h,再用磷酸緩沖液沖洗;②用10mL/L的鋨酸溶液于4℃固定4h,再用磷酸緩沖液沖洗;③300、500、700、800、900和1000mL/L乙醇梯度脫水(樣品在每個濃度乙醇中保持30min);④乙酸異戊酯置換,CO2臨界點干燥;⑤真空噴金;⑥用掃描電鏡觀察,拍照。設(shè)置空白對照。TEM標(biāo)本制備的主要步驟:①用戊二醛固定標(biāo)本2h,磷酸緩沖液漂洗;②無菌刀片刮取生物被膜;③鋨酸固定2h;④梯度乙醇、丙酮脫水;⑤618環(huán)氧樹脂包埋液浸透包埋,切片,厚度為60~80nm;⑥醋酸鈾,枸櫞酸鉛染色;⑦透射電鏡觀察,拍照。設(shè)置空白對照。2004年,Encina等分別用SEM、TEM研究了室溫條件下不同碳源對細(xì)菌生物被膜形成能力的影響,觀察到碳源不同細(xì)菌形成的生物被膜的結(jié)構(gòu)不同。2006年,Patrick等通過SEM和生物被膜環(huán)鑒定法(biofilmringtest)對李斯特桿菌(Listeriamonocytogenes)、大腸桿菌、葡萄球菌的生物被膜形成能力進(jìn)行了測定,得出生物被膜環(huán)鑒定法類似于微量板定量檢測法,但是得出結(jié)果比其更快,重復(fù)性更好的結(jié)論。2009年,Clauss等應(yīng)用SEM對金黃色葡萄球菌在各種骨移植和骨移植代替物上早期黏液物質(zhì)和生物被膜形成能力進(jìn)行了研究,表明在多孔材料表面金黃色葡萄球菌生物被膜被檢測到的時間比在光滑材料表面更短。相對于光學(xué)顯微鏡而言,電子顯微鏡具有放大倍數(shù)高、分辨率高、成像清晰和立體感強(qiáng)等諸多優(yōu)點。SEM放大倍數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了光學(xué)顯微鏡1000倍的極限,可達(dá)30萬倍甚至更高,電子顯微鏡的應(yīng)用使人類對生物被膜形態(tài)的研究進(jìn)入到了亞顯微水平。用SEM可以觀察生物被膜的表層結(jié)構(gòu),通過TEM和特殊多糖染色如剛果紅染色,可以更好地觀察生物被膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。但是,在樣品制備過程中,需要對生物被膜進(jìn)行固定、梯度脫水,這樣會導(dǎo)致樣品變形或者出現(xiàn)人為性的假象,比如蛋白質(zhì)的變性、酯類物質(zhì)的洗脫和細(xì)胞膜的破壞等。另外,在進(jìn)行真空噴金鍍膜以及臨界干燥時,也會對樣品的結(jié)構(gòu)造成一定的損壞,并且SEM及TEM由于造價昂貴,直接限制了這一技術(shù)在臨床上的應(yīng)用,不適合用于對細(xì)菌生物被膜的常規(guī)檢測。1.4利用clsm法觀察生物被膜的形成過程激光共聚焦掃描顯微鏡(confocallaserscanningmicroscope,CLSM)法是近年發(fā)展起來的用于組織形態(tài)學(xué)研究的一項新技術(shù),可對透光樣本進(jìn)行分層掃描拍攝,常用于細(xì)菌生物被膜立體結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)研究。CLSM由共聚焦顯微鏡和飛秒紅外激光兩部分組成,是光學(xué)顯微鏡與現(xiàn)代激光技術(shù)、高靈敏探測技術(shù)、掃描控制技術(shù)、微機(jī)圖像處理技術(shù)、熒光和標(biāo)記技術(shù)的結(jié)合。CLSM為生命科學(xué)開拓了一條觀察生命活細(xì)胞結(jié)構(gòu)及特定分子、離子生物學(xué)變化的新途徑,成為分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)和遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代強(qiáng)有力的研究工具。目前認(rèn)為CLSM法特別適合于細(xì)菌生物被膜原位結(jié)構(gòu)的研究。該鑒定方法所需要的主要儀器和試劑是激光共聚焦顯微鏡,無菌生理鹽水或無菌PBS緩沖液等。由于樣本不需要嚴(yán)格的脫水和固定,只需要將樣本用無菌生理鹽水或PBS緩沖液沖洗細(xì)菌生物被膜表層后便可以對樣本進(jìn)行觀察,記錄。通過CLSM,人們發(fā)現(xiàn)了生物被膜水道以及水道內(nèi)液體的對流現(xiàn)象,這一發(fā)現(xiàn)是生物被膜結(jié)構(gòu)認(rèn)識上的重大突破。利用CLSM和SEM觀察到成熟的生物被膜結(jié)構(gòu)是不均勻的,在這些微菌落之間圍繞著的輸水通道,可以運送養(yǎng)料、酶、代謝產(chǎn)物和排出廢物等,并發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在成熟的生物被膜中只占總體積的10%~20%,其余的成分為胞外多糖基質(zhì)、水道以及水道內(nèi)的水分等。此外,在其規(guī)律性排列的胞外多糖基質(zhì)和細(xì)菌微菌落之間還存在著許多有機(jī)物,例如核酸、蛋白質(zhì)、脂、磷脂和小分子的信息物質(zhì)等。有學(xué)者對口腔生物被膜中的多種細(xì)菌進(jìn)行了標(biāo)記,研究生物被膜開始形成時的狀況,直觀地觀察到了這些細(xì)菌相互促進(jìn)的黏附特性。利用CLSM,Jonathan等觀察了細(xì)菌在底物缺乏和充足時菌斑形成過程的特點,發(fā)現(xiàn)碳源在生物被膜形成的初期和成熟時對生物被膜結(jié)構(gòu)方面的影響最大。2007年,Naves等采用CLSM法對大腸桿菌生物被膜形成能力與毒力關(guān)系進(jìn)行研究,表明在強(qiáng)生物被膜菌株中普遍存在5個毒力相關(guān)基因。2010年,DeAraujo等采用CLSM法對肺炎克雷伯菌等位基因(lsrCDandtqsA)缺失突變株進(jìn)行了研究,觀察到2個點突變菌株(lsrCDandtqsA缺失突變)能夠形成更大的生物被膜,但是形成的生物被膜骨架不完整。用CLSM法觀察標(biāo)本無需嚴(yán)格的化學(xué)固定或包埋處理,可無損傷地原位顯示活的水化的細(xì)菌生物被膜結(jié)構(gòu),不受偏焦的干擾作用,可以從細(xì)菌生物被膜特定的部位、層面數(shù)字化獲得薄層層面圖像,這使人們能夠直接對生物被膜的四維(x、y、z、t)空間進(jìn)行觀察,以了解膜內(nèi)的菌體分布以及它們之間的相互關(guān)系,胞外產(chǎn)物及其他結(jié)構(gòu)。CLSM法還可以對不透明物體(如合成纖維、礦石和金屬等)表面生成的生物被膜進(jìn)行觀察,擴(kuò)展了生物被膜的研究范圍。雙光子的應(yīng)用,相對較低平均功率的紅外激發(fā),大大降低了對活細(xì)胞的損傷,延長了樣品觀察時間。脈沖激光散射和吸收程度小,透射性強(qiáng),對厚樣品的穿透可達(dá)400μm,是對厚組織分析的首選方法。和熒光分子探針技術(shù)相結(jié)合對生物被膜進(jìn)行觀察,可獲得生物被膜的菌體形態(tài)、生理及代謝變化、微環(huán)境、基質(zhì)物理結(jié)構(gòu)和多聚體的化學(xué)特性等詳細(xì)資料?；谝陨蟽?yōu)點,CLSM被認(rèn)為是目前最適合用于研究生物被膜結(jié)構(gòu)的儀器,已被生物被膜研究人員廣泛采用。但是,CLSM法存在費用昂貴的缺點,難以普及。因而,國內(nèi)采用CLSM在細(xì)菌生物被膜方面的研究進(jìn)展緩慢。1.5菌株生物被膜形成能力檢測微量板定量檢測法(polystyrenemicrotiterplateassay)是目前實驗室廣泛應(yīng)用的定量檢測細(xì)菌生物被膜的方法。主要試劑和儀器:聚苯乙烯微孔板、PBS緩沖液、甲醇、10g/LHucker結(jié)晶紫、吸光檢測儀。主要步驟:①在96孔聚苯乙烯微孔板中每孔加入100μL培養(yǎng)液,接種10μL過夜培養(yǎng)菌液,37℃靜置孵育36h;②用注射器將培養(yǎng)液吸出后加入200μL無菌的PBS緩沖液清洗板孔3次,除去浮游菌體;③用100μL甲醇固定15min,自然風(fēng)干后加入100μL10g/LHucker結(jié)晶紫于室溫下染色5min;④清洗與干燥同試管鑒定法;⑤完全干燥后每孔加入100μL的330mL/L冰醋酸溶液溶解結(jié)晶紫;⑥通過Sunrise吸光檢測儀測量D590nm值;⑦每次試驗每種菌株做3個孔的重復(fù),檢測3次取平均值;⑧以未接種菌的培養(yǎng)液D值作為陰性對照;⑨以陰性值的2倍作為界限值(Dc)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn),基于D值,菌株分為以下3類:強(qiáng)生物被膜形成株(2×Dc<D)、弱生物被膜形成株(Dc<D≤2×Dc)和無生物被膜形成株(D≤Dc)。2004年,Fox等采用微量板定量檢測法對分離自45個奶牛場的牛奶、奶牛乳頭皮膚和擠奶器的221個金黃色葡萄球菌的生物被膜形成情況進(jìn)行了研究,鑒定出牛奶中分離的葡萄球菌41.4%有生物被膜形成,皮膚和機(jī)器中分離的葡萄球菌分別為24.7%、14.7%有生物被膜形成,表明與牛奶密切相關(guān)的金黃色葡萄球菌比乳腺外源葡萄球菌更容易形成生物被膜,并證明生物被膜形成是奶牛乳內(nèi)感染的一個危險因素。2009年,Lizcano等對30個有擴(kuò)散能力和22個沒有擴(kuò)散能力的肺炎鏈球菌臨床分離株在酶標(biāo)板上形成早期生物被膜(earlybiofil-ms)的能力進(jìn)行了研究,闡明在酶標(biāo)板上強(qiáng)大的肺炎鏈球菌生物被膜產(chǎn)生能力是依賴于細(xì)菌生物被膜結(jié)構(gòu)和黏附在酶標(biāo)板表面的細(xì)菌群聚集厚度的,并且第一次闡明肺炎鏈球菌早期生物被膜形成能力與毒株分離自健康帶菌者還是入侵性疾病患者之間沒有相關(guān)性。2009年,Takayama等研究了鰻魚半乳糖凝集素(AJL-1)對牙周牙齦卟啉菌(Porphyromonasgingivalis)、中間普氏菌(Prevotellaintermedia)和線桿菌(Aggregatibacteractinomycetemcomitans)生物被膜形成的影響情況,表明AJL-1在牙周疾病上具有重要的治療價值。2005年,Kaplan等研究了副豬嗜血桿菌77個野毒株和15個參考株的生物被膜形成能力,觀察到野毒株中超過一半的菌株(包括代表血清1、5和7型的菌株)表現(xiàn)出生物被膜形成能力,但是只有2個參考株(血清5B和11型)表現(xiàn)出生物被膜形成能力,表明在田間分離的副豬嗜血桿菌中形成生物被膜是菌株普遍的表型,生物被膜與細(xì)菌定植、發(fā)病機(jī)理和細(xì)菌擴(kuò)散有密切關(guān)系。相對于平板計數(shù)鑒定法來說,微量板定量檢測法能夠大幅度縮小研究者的工作量,能較準(zhǔn)確地反映生物被膜含量,這對實驗室生物被膜研究工作是非常有利的。1.6生物被膜的檢測方法計算機(jī)圖像處理分析系統(tǒng)可將光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下直觀的圖像進(jìn)行量化,轉(zhuǎn)變成可統(tǒng)計分析處理的數(shù)字,可對影響生物被膜形成的因素進(jìn)行評價。生物發(fā)光分析法可以測定活菌ATP的含量,用于比較應(yīng)用抗生素前后生物被膜的變化,描記細(xì)菌的生長曲線,統(tǒng)計分析各種因素對生物被膜的影響。瓊脂平板菌