草莓莖尖培養(yǎng)及脫毒研究

草莓是薔薇科的一種多年生草本植物。這是一種漿果。在世界范圍內，食用漿果的栽培面積和產量低于葡萄糖，是世界水果。草莓是靠匍匐莖進行無性繁殖的作物,由于種植年限較長,加上連作、以結果母株繁苗等,體內病毒積累逐年增加,病毒病發(fā)生嚴重。感染了病毒的草莓生長緩慢、葉皺縮、果子一年比一年小、畸形、品質差,一般減產30%～80%,并逐年加重。在我國已造成損失的草莓病毒病主要有草莓斑駁病毒(SmoV),草莓輕型黃邊病毒(SMYEV),草莓鑲脈病毒(SVBV),草莓皺縮病毒(SCrV)等四種。王國平報道這四種病毒總侵染率為80.2%,其中單種病毒侵染率為41.6%,2種以上的病毒復合侵染率為38.6%。時至今日,病毒病已成為草莓主要病害之一,嚴重阻礙了草莓產業(yè)的進一步發(fā)展。對于病毒病,目前還沒有藥劑可以治理。因此,培育無病毒母本苗,栽培無病毒苗木,是防治草莓病毒病的根本對策。目前,世界上培育草莓無毒苗有3種方法:熱治療法、花藥培養(yǎng)法和莖尖培養(yǎng)法。用莖尖培養(yǎng)法進行無病毒苗的培育,是目前世界上獲得草莓無毒苗最普通且最有效的方法。1962年BelkengrenandMiller首先用組織培養(yǎng)的方法獲得了草莓無病毒苗。草莓無病毒苗具有明顯的恢復植株長勢和增產的效果。我國自鄧明琴(1981)通過草莓莖尖獲得了無病毒植株以來,也一直在從事這方面的研究,并逐步提出了一些改進措施。童堯明等以草莓莖尖分生組織(0.2mm～0.4mm(毫米))一次性培養(yǎng)出組培苗,出苗率為83%～90%,脫毒率達100%。覃蘭英等(1988)將草莓苗在35℃下熱處理7d(天)后,逐步升溫至38℃獲得100%的脫毒苗。高山林把切取的草莓芽洗凈后經過高溫短時間熱處理,然后用莖尖培養(yǎng)法獲得無病毒草莓苗。高遐虹等用二次脫毒法獲得無病毒草莓苗。但是一次性脫毒培養(yǎng)剝取的莖尖小,技術要求太高。傳統(tǒng)熱處理法由于較長時間的高溫高濕,很容易感染紅蜘蛛一類昆蟲危害,且熱處理后的材料在接種組培時,表面消毒不易徹底。改良熱處理的溫度及操作過程未見有報道。而且,近年來,用莖尖培養(yǎng)對草莓脫病毒的研究報道很多,但是,在電鏡及小葉嫁接法對脫病毒檢測方面上的報道很少見。本實驗針對以上三個方面的問題進行探索,對草莓莖尖脫毒培養(yǎng)進行研究,并結合熱處理,冷處理和二次脫毒等方法,為提高草莓莖尖脫毒培養(yǎng)尋找更適合的途徑和方法。1材料和方法1.1m4cm納米長的頂長本實驗以草莓匍匐莖為材料,截取3cm～4cm(厘米)長的頂端。品種為豐香,由青浦趙屯草莓資源圃提供,其中二次脫毒法所用的材料是一次脫毒的試管苗。1.2幼葉的誘導生根自田間選取健壯草莓母株上生長充實而小葉尚為展開的匍匐莖頂端約3cm～4cm(厘米)長的頂芽,用自來水沖洗2h～3h(小時)后,在超凈臺上進行常規(guī)滅菌處理。在雙筒解剖鏡下由外向內逐層剝去幼葉,切取0.5mm(毫米)左右大小莖尖接種于MS誘導培養(yǎng)基上誘導培養(yǎng),將分化出的小苗在1/2MS培養(yǎng)基上誘導生根。注:所有培養(yǎng)基均含有3%蔗糖,0.8%瓊脂,pH=5.6。1.2.1干燥劑的脫毒法1.2.1.莖尖生長點接種與培養(yǎng)在超凈工作臺上,分別以0.2mm、0.5mm、1.0mm(毫米)大小切取莖尖生長點接種于最佳誘導培養(yǎng)基上,移至培養(yǎng)室培養(yǎng)。1.2.1.葉原基、長度對培養(yǎng)莖尖的影響改良莖尖培養(yǎng)脫毒法,即二次脫毒培養(yǎng)法。先在解剖鏡下切取帶3～4個葉原基、長度為0.5mm(毫米)的莖尖生長點,進行培養(yǎng),兩個月后,當試管苗長到1cm～2cm(厘米)時,從中選取試管苗,再次切取0.5mm(毫米)的莖尖進行二次脫毒培養(yǎng)。1.2.1.莖尖的剝除改良熱處理+莖尖培養(yǎng)法,是將草莓匍匐莖洗凈后,35℃～50℃水浴處理4h(小時),再在無菌條件下剝取莖尖,切取0.5mm(毫米)大小進行培養(yǎng)。1.2.1.苗苗的培養(yǎng)自田間采取3cm～5cm高的草莓苗,栽在小花盆里,于10℃的低溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2個月,選健壯植株剝取0.5mm(毫米)莖尖進行培養(yǎng)。1.2.2集體培訓苗族遠離毒效果的確定1.2.2.指示植物的選擇草莓的病毒像其它多年生作物的病毒一樣,很難像一年生草本植物那樣,用汁液接種法進行鑒定。現(xiàn)在通常采用野生種草莓,按Bringhurst的小葉嫁接法來進行鑒定。本實驗所用的指示植物為UC10,其對草莓卷葉病毒有很好的檢測能力。首先是從被鑒定的草莓采集長成不久的新葉,除去兩邊的小葉,中央的小葉帶1cm～1.5cm(厘米)長的葉柄,把它削成鍥形作接穗;而指示植物除去中間的小葉,在葉柄的中央部切入1cm～1.5cm(厘米)再插入準備好的接穗,用細線扎好,涂上少量的白色凡士林以防干燥。每顆野生草莓做兩片葉子。嫁接后兩周為保持成活,罩上塑料薄膜袋。40d(天)后調查野生草莓卷葉病毒病發(fā)生情況。1.2.2.速度快,速度快用電子顯微鏡鑒定比小葉嫁接的指示植物鑒定法直觀,且速度快。主要方法是用負染法處理被測葉片,然后分別在15000、20000、30000倍下觀察,即可以清楚地看到細胞核及細胞質中是否有病毒粒子。2結果與分析2.1帶卷葉病毒檢測直接從豐香草莓匍匐莖上分別剝取0.2mm、0.5mm、1.0mm(毫米)大小的莖尖進行培養(yǎng),結果如表1所示。從表1可以看到草莓莖尖成活率受莖尖大小影響非常大。在相同培養(yǎng)基上,草莓莖尖越小,莖尖的成活率越低,反之,剝取的莖尖越大,莖尖的成活率越高。在最優(yōu)培養(yǎng)基MS+BA0.5mg/L(毫米/升)上。大小為0.2mm(毫米)的莖尖成活率為16.67%,大小為0.5mm(毫米)的莖尖成活率為66.67%,大小為1.0mm(豪米)的莖尖成活率為83.33%,可見,剝取的莖尖大小直接影響著草莓在培養(yǎng)基中的成活率。從表1還可以看出,以UC10野生草莓檢測各試管苗帶卷葉病毒情況,0.2mm(毫米)大小莖尖獲得的草莓試管苗經嫁接后,指示植物沒有皺縮現(xiàn)象發(fā)生(圖2-a)。而0.5mm(毫米)、1.0mm(毫米)大小莖尖的試管苗嫁接到UC10上后,UC10表現(xiàn)出不同程度的皺縮,與1.0mm(毫米)大小莖尖的試管苗相比,0.5mm(毫米)的要好得多(圖2-c、d)。從電鏡檢測結果來看,0.2大小莖尖得到的試管苗沒有檢測到病毒,0.5大小莖尖得到的試管苗經電鏡檢測每個視野可觀察到2個桿狀病毒(圖1-a),而1.0大小莖尖得到的試管苗中,每個視野可觀察到7個桿狀病毒和少量球狀病毒(圖1-c)?？梢?莖尖大小為0.2mm(毫米)的脫毒效果最好,0.5mm(毫米)次之,但綜合莖尖成活率而言,以0.5mm(毫米)莖尖大小為最理想。2.2高溫處理對設置試苗的處理效果從表2可以看出一定范圍內,隨著處理溫度的升高,剝取草莓莖尖的成活率隨之下降。在35℃時,剝取的莖尖成活率為57.14%,與對照(不經過高溫處理)的成活率62.50%,相差不大。當溫度升到40℃時,成活率降至47.37%,45℃以上草莓莖尖不能成活。經不同溫度處理得到的試管苗用UC10野生草莓嫁接,發(fā)現(xiàn)用35℃處理得到的試管苗在野生草莓上的嫁接表現(xiàn)與未經高溫處理的表現(xiàn)一致,都使野生草莓新生葉表現(xiàn)輕微皺縮(圖2-d),而經40℃和42℃高溫處理的匍匐莖剝取莖尖得到的試管苗經嫁接后,都表現(xiàn)出無皺縮。同樣電鏡檢測的結果也是如此,35℃處理和對照可用電鏡檢測到每視野2個桿狀病毒(圖1-a),40℃和42℃處理檢測不到病毒。可見經40℃～42℃高溫處理匍匐莖后再剝取莖尖,得到的試管苗能達到100%脫毒率。但綜合成活率考慮,只需用40℃處理就可以了。2.3再生苗中主要病毒類型為了建立更好的脫毒體系,采用幾種方法進行比較:直接莖尖脫毒、二次莖尖脫毒、改良熱處理結合莖尖脫毒、冷處理結合莖尖脫毒。表3可以看出,4種莖尖脫毒方法中,直接莖尖脫毒法的成活率最高,為66.67%;其次為改良熱處理結合莖尖脫毒法,為47.37%;然后是冷處理的莖尖脫毒法,成活率為44.44%;最低的是二次莖尖脫毒法,成活率只有26.67%。根據(jù)表3結果,以UC10野生草莓檢測各試管苗帶卷葉病毒情況,直接剝取莖尖大小為0.5mm(毫米)獲得的試管苗以UC10野生草莓嫁接檢測發(fā)現(xiàn)有輕微皺縮(圖2-d),以電鏡檢測發(fā)現(xiàn),每個視野中可以觀察到2個桿狀病毒(圖1-a)。改良熱處理、二次脫毒及冷處理的脫毒方法處理的草莓試管苗經嫁接后,野生草莓上都沒有皺縮現(xiàn)象發(fā)生,電鏡檢測也觀察不到病毒粒子。而對照(直接田間繁殖)的草莓苗用野生草莓嫁接,新生葉表現(xiàn)出嚴重皺縮,電鏡檢測發(fā)現(xiàn)每個視野中可觀察到多達16個病毒(圖1-d、e)。其中除了桿狀病毒外,還觀察到了球型病毒?？梢娡ㄟ^莖尖培養(yǎng)的方法來繁殖種苗能有效的去除草莓體內所帶的病毒,且三種改良的草莓莖尖脫毒方法都要比直接剝取莖尖的方法更有效,脫毒率達到100%。其中以40℃處理的改良熱處理+莖尖培養(yǎng)法的成活率最高,可達到47.37%。3討論3.1安全性苗的繁殖在脫毒苗的繁殖過程中,最重要的是防止再次感染。首先是脫毒苗在馴化過程中,所用基質必須用蒸汽或用藥劑消毒,以防治土壤病菌和線蟲。其次是防止病毒介體——葉蟬和蚜蟲傳毒,對原種苗僅僅噴藥防治是不夠的,需用0.4mm～0.5mm(毫米)大小的防蟲網進行隔離。二級種苗必須選擇草莓原種苗作母株,在隔離條件下的專用苗圃內進行繁殖,苗圃和周圍草莓園隔離至少2km(公里),苗圃的土壤要經過氯化苦農藥消毒。避免在栽過草莓的土地重茬繁殖無毒苗,并注意定期防治蚜蟲。無病毒原種苗可供繁殖3年。無病毒草莓苗的繁殖主要采用匍匐繁殖法。該法具有分生量大、速度快、苗質量好等特點。無毒苗繁殖分三個圃:原原種圃、原種圃、生產圃。原原種生產原種,原種生產生產種。這一過程不僅可以大量繁殖生產用苗,還可以及時進行脫毒效果和變異的鑒定。在防蟲網室中對原原種苗進行編號定植,在其后代苗——原種圃中分別進行匍匐莖扦插繁殖,仍然按原原種苗的母株進行編號,然后在生產圃中對編號的原種苗進行生產試種,這樣可以直接地鑒定其脫毒效果和變異。一旦發(fā)現(xiàn)在生產上表現(xiàn)不良,就可按編號全部清除其原原種、原種母株及后代,停止繁殖生產用苗,這樣就可以保證生產用苗為無變異的脫毒健壯苗。為長遠利益打算,嚴格隔離的防蟲網室必須建立。研究機構應主動與生產單位聯(lián)系,指導其建立防蟲網室,并培訓技術人員在防蟲網室中的種苗生產流程。唯有這樣,才能將草莓脫毒健壯苗推向廣大種植戶。3.2再生方法較污的原因在于,立本實驗結果表明,莖尖培養(yǎng)過程中,剝取莖尖,開始培養(yǎng),3d～7d(天)陸續(xù)轉綠、膨大;14d～28d(天)后形成黃綠色愈傷組織;42d～49d(天)后增殖完成,40d(天)左右繼代一次,生根要20d(天)左右,移栽到大田,4個月后開花結果。與鄧群仙、洪燕萍等報道的一致。高遐紅等認為改良的莖尖剝離方法(二次脫毒法)比傳統(tǒng)莖尖剝離法的分化率高,污染率要低。本實驗研究表明,結果恰好相反,改良的莖尖剝離法比傳統(tǒng)莖尖剝離法的分化率低、污染率高。其原因估計是因為試管苗比田間苗嫩、水分含量多,且試管苗長度太短,切取莖尖時,操作比較困難,又由于操作過程中,手的消毒很難徹底,所以很容易引起污染。直接莖尖剝取法,剝取莖尖0.1mm～0.2mm(毫米)時,脫毒率可達100%。但是技術要求高、不易掌握、費時間。本實驗所用的改良莖尖培養(yǎng)法剝取的莖尖都為0.5mm(毫米)大小,獲得的試管苗經電鏡及小葉嫁接法鑒定表明,脫毒率都達100%。但是冷處理+莖尖培養(yǎng)法中,冷處理所需的時間長,而且需將整株植株放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2個月,成本高,