pda培養(yǎng)基配方的改良

土壤培養(yǎng)部位（pda）是最常用的培養(yǎng)部位。土豆塊莖中含淀粉15%~25%,蛋白質(zhì)2%~3%,脂肪0.7%,粗纖維0.15%,還含有豐富的鈣、磷、鐵、鉀等礦物質(zhì)及維生素C、維生素A和B族類維生素,營養(yǎng)豐富,所以常用于食品發(fā)酵類霉菌的培養(yǎng)。新鮮的土豆營養(yǎng)物質(zhì)豐富,但由于季節(jié)限制大部分時間都買不到新鮮土豆,長時間保藏會使土豆中的營養(yǎng)物質(zhì)流失,而且土豆蒸煮后各種營養(yǎng)素的流失導(dǎo)致其營養(yǎng)成分含量降低,會對霉菌的生長繁殖產(chǎn)生一些不良影響,例如導(dǎo)致霉菌絲長的細小、不夠旺盛、暗淡無光等,從而影響菌株產(chǎn)酶活力。鑒于此,本實驗擬用食品釀造工業(yè)常用的米根霉菌為模式菌種,以保藏土豆為原料,通過單因素和正交試驗分別對PDA配方進行改良研究。以期研究出原料廉價易得,營養(yǎng)又能完全滿足菌種生長且制備方法簡便的培養(yǎng)基,為釀造企業(yè)及相關(guān)的研究提供一定的參考。1材料和方法1.1實驗室提供原料菌種:米根霉2-2試管種,均由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實驗室提供。原料:土豆、玉米;桔子、麩皮:市售。藥品:酵母膏、牛肉膏、蛋白胨(生化試劑);無水硫酸銅、次甲基藍、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、亞鐵氯化鉀、無水葡萄糖、冰醋酸、醋酸鈉、可溶性淀粉,試劑均為分析純。1.2測試方法1.2.1小塊的制備PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基:200g土豆,洗凈去皮切成小塊,加水1000mL煮沸25min;紗布過濾,濾液加水補足1000mL,再加入20g葡萄糖及20g瓊脂,加熱讓其充分溶解即可。1.2.2制備膏、東南角玉米汁在PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,分別添加不同比例的牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、桔子汁、玉米汁等,然后滅菌倒平板,編號;冷凝后將米根霉孢子點接在培養(yǎng)皿中央,同時做空白對照,30℃培養(yǎng)16h時進行第一次觀察并記錄菌落直徑及生長狀態(tài),24h時進行第二次觀察記錄。1.2.3pda最佳改良配方的確定通過單因素試驗對菌落生長狀況進行比較后,確定出菌絲生長較好的因素水平,采用L9(34)表進行正交試驗,運用DPSv6.55統(tǒng)計軟件處理,采用新復(fù)極差法進行統(tǒng)計處理與顯著性驗證,以確定PDA最佳改良配方。1.2.4糖化酶活力測定將麩皮和水以2∶1進行混合,分裝到三角瓶中。經(jīng)高壓滅菌后,將用改良PDA或基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)的根霉菌接種到相應(yīng)的三角瓶中,30~32℃培養(yǎng)2d,取出麩皮培養(yǎng)物裝入無菌袋中烘干,然后測定培養(yǎng)物的糖化酶活力。酶活力越高,生產(chǎn)性能越好。2結(jié)果與分析2.1最優(yōu)氮源確定氮源是影響霉菌生長繁殖的主要因子之一。通過添加不同氮源觀察米根霉培養(yǎng)16h和24h后的菌落特征及生長狀況,以確定不同氮源對PDA平板培養(yǎng)基上米根霉生長繁殖的影響,從而確定改良培養(yǎng)基的最優(yōu)氮源。2.1.1菌落直徑隨時間的變化米根霉在添加牛肉膏的PDA培養(yǎng)基上的生長特征見表1。由表1可知,牛肉膏添加比例在0.1%~0.3%內(nèi)隨著牛肉膏添加量的增加,菌落直徑也隨之增大;比例在0.3%~0.5%時隨著牛肉膏量的增加菌落直徑隨之變小?？梢娒赘乖谔荻葹?.3%的牛肉膏培養(yǎng)基上的生長較其他梯度好,生長16h后,菌落直徑可達59mm,且菌絲較粗,亮白光澤;24h后產(chǎn)孢子數(shù)量增加明顯,菌株繁殖力較強。2.1.2蛋白對米根霉生長的影響米根霉在添加蛋白胨的PDA培養(yǎng)基上的生長特征見表2。由表2可知,米根霉的生長速度(直徑大小)隨著蛋白胨梯度的增加總體無明顯變化。整體上菌絲細小雜亂,產(chǎn)孢子量較少,菌落直徑最大只有51mm;與在加牛肉膏平板上相比生長速度較慢,總體看蛋白胨對米根霉的生長沒有較明顯的影響。其原因可能是米根霉生長對氮源具有選擇性,對蛋白胨中氮的利用率相對較低。2.1.3霉菌絲的制備米根霉在添加酵母膏的PDA培養(yǎng)基上的生長特征見表3。由表3可知,酵母膏對米根霉生長的影響較大,在添加酵母膏的培養(yǎng)基上米根霉菌絲生長粗壯,亮白有光澤,稠密度適中。酵母膏添加量為0.1%~0.4%時,隨著添加量的增加,菌落直徑也隨之增大;添加量為0.4%,培養(yǎng)16h時,菌落直徑可達67mm,比加牛肉膏的最大菌落直徑多8mm,與加蛋白胨相比最大菌落直徑相差達16mm,菌絲也更粗壯、更亮白。24h時各梯度的培養(yǎng)基中都長出較多孢子,因此,選擇酵母膏和牛肉膏為氮源進行下一步正交試驗。2.2制備對米根霉的影響米根霉在加桔子汁的PDA上培養(yǎng)16h和24h后菌落特征及生長狀況見表4。由表4可知:與對照相比,桔子汁對米根霉的影響較小。在添加量為6%的PDA上生長16h時的菌落直徑最大達49mm,菌落直徑最小為44mm,菌絲細小、暗淡無光、生長較弱。整體上看,加桔子汁對米根霉生長基本無益。2.3玉米汁對米根霉生長的影響玉米含有較多的硒和鎂,還含有豐富的賴氨酸、纖維素、木質(zhì)素以及谷胱氨酸。這些營養(yǎng)物質(zhì)可作為根霉菌生長繁殖所需的生長因子。通過觀察米根霉在加玉米汁的PDA上培養(yǎng)16h和24h后的菌落特征及生長狀況,研究玉米汁對米根霉生長的影響,結(jié)果見表5。由表5可知,整體上米根霉在含玉米汁的PDA上菌絲生長疏密適中,較亮白,生長速度較快,說明玉米汁對米根霉的生長有較明顯的促進作用。添加量在4%時,菌絲粗壯、亮白,培養(yǎng)16h時菌絲直徑最大達到53mm,與對照菌落直徑相差達到4mm;24h時長出大量黑孢子,菌株活力較強。所以選取玉米汁進行下一步正交試驗。2.4添加各類改良劑對米根霉糖化酶的影響經(jīng)單因素試驗比較確定,分別添加4%玉米汁、0.3%牛肉膏、0.4%酵母膏的PDA培養(yǎng)基明顯有利于米根霉的生長繁殖,菌株生長好就會達到良好的產(chǎn)酶效果。因此,實驗采用L9(34)正交試驗在基礎(chǔ)PDA中同時添加玉米汁、酵母膏、牛肉膏,以期獲得最佳改良PDA培養(yǎng)基配方及此配方下菌株產(chǎn)糖化酶的結(jié)果。因素水平安排見表6,產(chǎn)糖化酶正交實驗結(jié)果見表7。由表7可知,各因素影響米根霉糖化酶活力的主次順序為C(酵母膏)>A(玉米汁)>B(牛肉膏),C(酵母膏)對米根霉糖化酶力影響最大,具有顯著影響(方差分析顯示P<0.05),其次是A(玉米汁),最后為B(牛肉膏)。直觀分析表明,糖化酶活力最高的最佳培養(yǎng)基配比是A1B3C3,即在基礎(chǔ)PDA中同時添加玉米汁3.5%、牛肉膏0.25%、酵母膏0.45%。2.5糖化酶活力檢測根據(jù)正交試驗結(jié)果,將同一菌株分別用改良PDA和基礎(chǔ)PDA培養(yǎng),然后檢測其糖化酶活力。改良PDA所培養(yǎng)菌株的糖化酶活力為1374U/g,基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)的糖化酶力為1190U/g。結(jié)果表明,經(jīng)改良的PDA培養(yǎng)基更適合米根霉生長繁殖。3不同菌株對米根霉糖化酶的活性比較在單因素試驗基礎(chǔ)上,通過對牛肉膏、酵母膏、玉米汁進行3因素3水平正交試驗,經(jīng)方差分析后得出改良配方:PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加牛肉膏0.25