產(chǎn)蛋白酶的米谷蛋白功能性質(zhì)研究

大米中的蛋白質(zhì)含量為8%13%。該蛋白質(zhì)具有無(wú)色、柔和、所需氨基酸含量高、低過(guò)敏和低膽固醇等特點(diǎn)。但是,蛋白質(zhì)中高含量的谷氨酰胺及天冬酰胺之間通過(guò)氫鍵等結(jié)合使蛋白質(zhì)聚集沉淀,導(dǎo)致其溶解度較低;同時(shí)低溶解度也會(huì)影響到蛋白的其他功能性質(zhì)例如起泡性、乳化性及凝膠性等,從而限制了其在食品中的應(yīng)用。研究表明,酸法對(duì)大米蛋白的脫酰胺可顯著改善其溶解度,但是高溫下的酸處理過(guò)程中,蛋白質(zhì)肽鏈的水解和其他氨基酸殘基的降解是不可避免的;蛋白酶等也已應(yīng)用于大米蛋白的脫酰胺,并有助于改善其溶解性及其他功能性質(zhì),但是蛋白酶可能引起肽鏈的水解,產(chǎn)生不良的風(fēng)味,以及氨基酸的消旋等。近年來(lái),發(fā)現(xiàn)一種新酶——蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶(glutaminase)應(yīng)用于小麥蛋白及玉米醇溶蛋白的脫酰胺中可顯著提高其溶解度和乳化性,蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶僅作用于蛋白質(zhì)或肽的谷氨酰胺基團(tuán),而對(duì)天冬酰胺殘基或游離谷氨酰胺沒(méi)有影響,同時(shí)不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)肽鏈的交聯(lián)和水解。本研究以谷氨酰胺酶應(yīng)用于大米蛋白的主要成分——米谷蛋白(占大米蛋白的80%以上)的脫酰胺改性,觀察谷氨酰胺酶脫酰胺對(duì)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的影響,對(duì)進(jìn)一步提高大米蛋白產(chǎn)品質(zhì)量,開(kāi)發(fā)性能更優(yōu)良、應(yīng)用范圍更廣的新型食品有著重要意義。1材料和方法1.1材料和試劑秈米碎米由湖南省霞凝糧庫(kù)提供。谷氨酰胺酶美國(guó)Sigma公司;所有其他化學(xué)試劑均為分析純。1.2織粉碎機(jī)、回用儀器UV2600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;DS-1高速組織搗碎機(jī)上海標(biāo)本模型廠;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;DELTA320pH計(jì)梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SK-1型快速混勻器金壇市醫(yī)療儀器廠;烏氏黏度計(jì)中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司。1.3方法1.3.1蛋白質(zhì)液的制備米谷蛋白提取工藝如下,實(shí)驗(yàn)中提取溫度為室溫,提取2h,3000r/min離心15min。大米粉→正己烷脫脂→室溫下自然干燥24h→蒸餾水提取清蛋白(料液比1:10(m/V))→離心→質(zhì)量濃度5g/100mL的氯化鈉溶液提取球蛋白(料液比1:10)→離心→70%的乙醇溶液提取醇溶蛋白(料液比1:5)→離心→沉淀水洗→0.05mol/L氫氧化鈉溶液(料液比1:10)→離心→上清液用質(zhì)量濃度12g/100mL的三氯乙酸溶液調(diào)節(jié)pH值至等電點(diǎn)4.8→離心→透析→冷凍干燥→產(chǎn)品1.3.2谷氨酰胺酶解反應(yīng)單因素反應(yīng)稱取1g米谷蛋白,邊攪拌邊加入盛有磷酸鹽緩沖溶液(200mmol/L,pH7.0)的恒溫酶反應(yīng)器內(nèi),形成底物質(zhì)量濃度(1±0.002)g/100mL的分散懸浮液,攪拌30min后加入一定量的谷氨酰胺酶(酶與底物比為1:5)進(jìn)行酶解反應(yīng),酶解反應(yīng)溫度37℃,反應(yīng)時(shí)間0~48h。反應(yīng)結(jié)束后用0.1mol/L的醋酸溶液透析,然后樣品凍干備用。1.3.3不同ph值的緩沖溶液和醋酸鈉緩沖溶液的配制采用福林-酚法測(cè)定不同pH值條件下米谷蛋白及其脫酰胺樣品的溶解度。準(zhǔn)確稱取凍干樣品(10mg)分散于10mL不同pH值的緩沖溶液(pH3、10mmol/L的醋酸緩沖溶液;pH5、10mmol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液;pH7、10mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液)中,20℃攪拌過(guò)夜,3000r/min離心30min收集可溶性組分,取1mL溶液用福林-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量,用牛血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.3.4sds-ls法采用濁度法測(cè)定。取質(zhì)量濃度為(0.1±0.0005)g/100mL的蛋白溶液75mL,調(diào)pH值至所需值(pH3、pH5、pH7)后轉(zhuǎn)入高速組織搗碎機(jī),再加入25mL茶籽油,20000r/min均質(zhì)2min,記錄油層體積V0。用微量注射器從乳液底部取100μL乳液迅速與10mL質(zhì)量濃度0.1g/100mL的SDS溶液混合,在500nm波長(zhǎng)處比色,記錄吸光度(A0),30min后同樣稀釋比色,記錄吸光度(At)。大米蛋白的乳化能力用乳化性和乳化穩(wěn)定性表示。1.3.5城市高速組織粉碎法取質(zhì)量濃度為(0.1±0.0005)g/100mL的蛋白溶液100mL,用0.05mol/L的氫氧化鈉溶液或鹽酸調(diào)pH值至所需值(pH3、pH5、pH7)后轉(zhuǎn)入高速組織搗碎機(jī),20000r/min攪拌2min,迅速轉(zhuǎn)入250mL的量筒中,盡快記錄泡沫的體積(V0),靜置30min后測(cè)量下層析出溶液的體積(Vt)。分別按式(3)、(4)計(jì)算大米蛋白的起泡性及起泡穩(wěn)定性。1.3.6內(nèi)標(biāo)粘度法采用烏氏黏度計(jì)法,按式(5)計(jì)算特性黏度。式中:t為蛋白溶液流出時(shí)間;t0為純?nèi)軇┝鞒鰰r(shí)間;C為蛋白溶液質(zhì)量濃度/(g/mL)。1.3.7持水能力及持油能力測(cè)定持水能力測(cè)定:準(zhǔn)確稱取100mg蛋白質(zhì)樣品置于50mL質(zhì)量為m1的離心管中,加蒸餾水5mL,用磁力攪拌器使蛋白質(zhì)溶液分散均勻。測(cè)量樣液的pH值,并調(diào)至pH7.0,在40℃恒溫水浴中保溫30min,9000r/min離心10min傾去上清液,稱取離心管的質(zhì)量記為m2,計(jì)算每克蛋白質(zhì)樣品的持水能力。持油能力測(cè)定:準(zhǔn)確稱取100mg蛋白質(zhì)樣品置于50mL質(zhì)量為m1的離心管中,加茶籽油5mL,用磁力攪拌器使蛋白質(zhì)溶液分散均勻。在40℃恒溫水浴中保溫30min后,9000r/min離心10min傾去上清液,稱取離心管的質(zhì)量記為m2,計(jì)算每克蛋白質(zhì)樣品的持油能力。2結(jié)果與分析2.1分沉淀、分散從圖1可以看出,當(dāng)酶處理時(shí)間低于3h時(shí),只有少量蛋白質(zhì)在溶液中分散,大部分沉淀于試管底部;酶處理時(shí)間在5~20h之間,溶液呈渾濁狀,有少量沉淀沉于試管底部;酶解20h以上時(shí),蛋白質(zhì)基本分散于溶液中,得到比較均勻的溶液,由此可知隨著酶處理時(shí)間的延長(zhǎng),米谷蛋白由于脫酰胺逐漸分散于中性水溶液中。2.2谷氨酰胺酶脫酰胺反應(yīng)中的溶解度研究米谷蛋白及其脫酰胺樣品在酸性pH值(pH3和pH5)以及中性pH值(pH7)條件下溶解度的變化情況(圖2)。未經(jīng)酶修飾的米谷蛋白在強(qiáng)酸性溶液中(pH3.0)溶解性良好,達(dá)到78.15%,在等電點(diǎn)pI4.8左右(pH5)的溶液及中性溶液(pH7)中的溶解度相當(dāng)?shù)?僅1.71%和6.18%。經(jīng)谷氨酰胺酶脫酰胺作用的米谷蛋白在pH5和中性條件下的溶解度顯著上升,酶解48h時(shí)溶解度分別達(dá)到86.88%和96.99%,而在強(qiáng)酸性溶液中的溶解度有所降低。從圖2還可以看出,即使谷氨酰胺酶脫酰胺反應(yīng)的時(shí)間非常短(1h),pH7時(shí)其溶解度也達(dá)到了56.83%,結(jié)果表明,谷氨酰胺酶導(dǎo)致的米谷蛋白的脫酰胺使得蛋白質(zhì)聚合體解聚以及蛋白質(zhì)粒子間的靜電排斥作用增強(qiáng),顯著增加了其在中性條件下的溶解度。弱酸性(pH5)條件下溶解度的增加是由于脫酰胺導(dǎo)致的羧化作用使得蛋白質(zhì)等電點(diǎn)降低,強(qiáng)酸性條件下(pH3)溶解度的降低有可能是由于修飾后蛋白質(zhì)表面帶負(fù)電荷,在強(qiáng)酸溶液中正負(fù)電荷抵消,脫酰胺后的蛋白質(zhì)分子打開(kāi),暴露出更多的疏水基團(tuán),疏水相互作用大于靜電排斥作用,導(dǎo)致溶解度降低。2.3米谷蛋白在酸性條件下乳化乳化體系在熱力學(xué)上為不穩(wěn)定的分散體系,蛋白質(zhì)是兩性高聚物,具有親水、親油的基團(tuán)和區(qū)域,可以起到穩(wěn)定乳化體系的作用。圖3為米谷蛋白及其脫酰胺樣品分別在pH3、pH5及pH7時(shí)的乳化性及乳化穩(wěn)定性。由圖3可知,酶處理后的米谷蛋白在強(qiáng)酸性溶液中的乳化性略有改善,但在弱酸性溶液(pH5)中則大大降低,中性溶液中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。米谷蛋白在酸性條件下乳化穩(wěn)定性較好,改性后在強(qiáng)酸性及中性溶液中反應(yīng)時(shí)間小于5h時(shí)穩(wěn)定性較好,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)穩(wěn)定性變差,而在弱酸性溶液中穩(wěn)定性最不理想。改性后米谷蛋白在中性溶液中乳化性及穩(wěn)定性較好是因?yàn)槿闋钜阂褐楸砻鎺ж?fù)電,液滴相互接近時(shí)產(chǎn)生排斥力,防止液滴聚結(jié),同時(shí)吸附帶相反電荷的離子,形成類(lèi)似于Stern層的混合層,使溶液中的離子分布發(fā)生重排,使水與油相的電位差增大,足以使乳狀液穩(wěn)定。在強(qiáng)酸性溶液中乳化性提高幅度不大的原因可能是乳狀液液滴表面的部分電荷被中合,導(dǎo)致兩相界面電位差減小,但穩(wěn)定性比較好可能是蛋白質(zhì)在強(qiáng)酸性溶液中的界面膜強(qiáng)度大,有利于乳狀液的穩(wěn)定;酶解5h后的米谷蛋白乳化穩(wěn)定性下降,可能是蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)一步展開(kāi),更多的疏水基團(tuán)暴露,導(dǎo)致親水性變差,從而影響乳化性及其穩(wěn)定性。在弱酸性條件下,酶處理樣品的溶解度有所增加,而乳化性及其穩(wěn)定性卻較差,Hamada認(rèn)為溶解度不是關(guān)聯(lián)乳化性和乳化穩(wěn)定性的唯一因素,還有更多的關(guān)鍵因素會(huì)影響到油相表面的蛋白質(zhì)吸附層,從而影響到乳狀液滴的靜電排斥和立體位阻。2.4不同ph值對(duì)原蛋白發(fā)泡穩(wěn)定性的影響谷蛋白有較好的發(fā)泡性質(zhì),可以形成具有一定機(jī)械強(qiáng)度的薄膜,但泡沫易受溶液pH值的影響,并有老化現(xiàn)象。圖4為米谷蛋白在pH3、pH5及pH7時(shí)的起泡性及起泡穩(wěn)定性。從圖4A可知,原蛋白的起泡性在強(qiáng)酸性pH值下最好,改性后隨著酶解時(shí)間的增加起泡性變得更好。在弱酸性及中性pH值下原蛋白的起泡性很低,改性后得到改善。由于pH3時(shí)原始米谷蛋白溶解度高,有利于界面上的蛋白質(zhì)相互作用形成黏稠的膜,同時(shí)吸附在界面的蛋白質(zhì)數(shù)量增多,有利于形成剛性膜,故此時(shí)的起泡性較好,改性后3種條件下蛋白質(zhì)三、四級(jí)結(jié)構(gòu)展開(kāi),暴露出更多的疏水基團(tuán),結(jié)構(gòu)變得疏松,提高了濕潤(rùn)性,有利于蛋白質(zhì)快速地分散至氣-水界面,降低界面張力,從而使起泡性隨著酶解時(shí)間的增加而增強(qiáng)。從圖4B可知,在弱酸條件下起泡穩(wěn)定性最好,原蛋白起泡穩(wěn)定性優(yōu)于改性后的蛋白質(zhì),且改性后隨著酶解時(shí)間的增加穩(wěn)定性呈下降趨勢(shì)。原因是在弱酸性條件下,雖然起泡力不佳,但不溶解部分的蛋白質(zhì)有利于增加膜的黏合力,從而穩(wěn)定泡沫;原蛋白的起泡穩(wěn)定性好主要源于它的相對(duì)分子質(zhì)量較大,能在氣泡周?chē)纬删哂幸欢▌傂院秃穸鹊牡鞍啄?改性后起泡穩(wěn)定性呈下降趨勢(shì)的原因是酶處理使蛋白質(zhì)分子內(nèi)的氫鍵打開(kāi),靜電排斥作用增強(qiáng),部分肽鏈打開(kāi),相對(duì)分子質(zhì)量減小,不利于分子間相互結(jié)合形成具有黏彈性的蛋白膜。2.5米谷蛋白酶解處理對(duì)大米蛋白黏度的影響溶液的黏度與高聚物的分子質(zhì)量、分子結(jié)構(gòu)形態(tài)和在溶劑中的擴(kuò)張程度有關(guān),流體在流動(dòng)時(shí),由于分子間的相互作用,產(chǎn)生了阻礙運(yùn)動(dòng)的內(nèi)摩擦力,黏度就是這種摩擦力的表現(xiàn)。圖5為大米蛋白的黏度隨酶解時(shí)間的變化圖。由圖5可知,米谷蛋白的特性黏度較高,改性后蛋白質(zhì)的特性黏度明顯降低。原因是米谷蛋白的分子鏈長(zhǎng)且有柔順性,在溶液中成無(wú)規(guī)線團(tuán)流動(dòng),分子鏈內(nèi)與分子鏈間都不同程度地相互纏結(jié)和內(nèi)摩擦,同時(shí)分子鏈中包含一定量的溶劑分子,使體系濃度相對(duì)增大,從而特性黏度較大。改性后米谷蛋白聚合體緩慢解離,蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量減小,分子鏈間的纏結(jié)與內(nèi)摩擦力減弱,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶液的特性黏度降低。2.6酶解對(duì)蛋白質(zhì)持水力和持在食品品質(zhì)指標(biāo)的影響蛋白質(zhì)的持水能力(waterbindingcapacity,WBC)是指蛋白質(zhì)將水截留或保留在其組織中的能力。對(duì)于食品體系,一種蛋白質(zhì)制劑的持水能力與其結(jié)合水能力有關(guān),可影響食品的嫩度、多汁性、柔軟性、所以持水力對(duì)食品品質(zhì)具有重要的實(shí)際意義。同時(shí)蛋白質(zhì)的持油性能在肉制品、奶制品以及餅干夾心等食品配方及加工中起著非常重要的作用,對(duì)于擴(kuò)大改性大米蛋白的應(yīng)用范圍,其持水和持油性也是非常重要的指標(biāo)。從圖6可知,隨著酶解時(shí)間的增加,蛋白質(zhì)持水力增加,當(dāng)酶解12h時(shí)持水力開(kāi)始下降。原因是谷氨酰胺酶使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開(kāi),形成松散的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而截留更多的水分子,持水性提高1.75~2.03倍,但隨著酶解時(shí)間的增加,蛋白質(zhì)分子進(jìn)一步展開(kāi),暴露出更多的疏水區(qū)域,導(dǎo)致親和水的能力減弱。對(duì)不同酶解時(shí)間的大米蛋白持油性分析結(jié)果表明,脫酰胺處理后的蛋白樣品持油性提高1.58~1.94倍,而酶解時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)持油性并無(wú)顯著影響。3酶解時(shí)間對(duì)乳化穩(wěn)定性的影