無菌試驗(yàn)操作規(guī)程1．目的建立無菌檢查的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性。2．范圍本規(guī)程適用于本公司質(zhì)檢部對本廠生產(chǎn)的一次性血路導(dǎo)管的無菌檢驗(yàn)。3．引用標(biāo)準(zhǔn)《中華人民共和國藥典》2010版第二部附錄XIH無菌檢查法《中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》2010年版無菌檢查法GB/T14233.3-2005醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法第二部分：生物學(xué)4．儀器設(shè)備和試劑4.1儀器設(shè)備無菌室、無菌服、口罩、手套、超凈工作臺、電子天平、pH計(jì)、、光學(xué)顯微鏡、生化培養(yǎng)箱、壓力蒸汽滅菌器、電熱干燥箱、微生物限度儀器、接種環(huán)、酒精燈、試管、試管塞、試管架、培養(yǎng)皿、三角瓶、玻璃棒、酒精棉。4.2試劑75%醫(yī)用級乙醇、質(zhì)量濃度為0.9%無菌氯化鈉溶液、傳1代金黃色葡萄球菌、生孢梭菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單孢菌、白色念珠菌、黑曲霉。培養(yǎng)基：平板：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基需氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基真菌培養(yǎng)基：改良馬?。ō傊┡囵B(yǎng)基5．試驗(yàn)前準(zhǔn)備和方法5.1試驗(yàn)前準(zhǔn)備5.1.1器具滅菌與供試液接觸的所有器具應(yīng)采用可靠方法滅菌，置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121℃30min，或置電熱干燥箱內(nèi)160℃2h。5.1.2無菌室要求無菌室操作臺或超凈工作臺局部應(yīng)符合潔凈度100級單向流空氣區(qū)域要求。無菌室在消毒處理完畢后，應(yīng)檢查空氣中的菌落數(shù)，方法如下：取直徑約90mm培養(yǎng)皿，無菌操作注入融化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約20mL，在30~35℃培養(yǎng)48h證明無菌后，取3只培養(yǎng)皿在無菌室操作臺或超凈工作臺平均位置打開上蓋，暴露30min后蓋好30~35℃培養(yǎng)48h后取出檢查。3只培養(yǎng)皿上生長的菌落數(shù)平均應(yīng)不超過1個。5.1.2培養(yǎng)基無菌性檢查（每配置一批培養(yǎng)基檢查一次）每批配置的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行無菌性檢查。檢查時，每批隨機(jī)抽取不少于5支，培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長。5.1.3培養(yǎng)基靈敏度檢查（每購進(jìn)一批培養(yǎng)基檢查一次）5.1.3供試品抑菌性驗(yàn)證試驗(yàn)對未知或可疑的供試品，在進(jìn)行無菌試驗(yàn)前，應(yīng)按照《中國藥典》二部附錄中“無菌檢查法”的規(guī)定進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)，以確認(rèn)供試品在該試驗(yàn)條件下無抑菌活性或可以忽略不計(jì)。5.2試驗(yàn)方法5.2.1供試品數(shù)量同一批號3個~11個單位供試品。5.2.2浸提介質(zhì)質(zhì)量濃度為9g/L的無菌綠環(huán)溶液或其他符合《中國藥典》要求的稀釋液和沖洗液。5.2.3供試液制備優(yōu)先采用將供試品或其有代表性的各部分直接投放入培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。如供試品不適宜直接投放，可按下列方法制備供試液，應(yīng)使浸提介質(zhì)充分洗滌供試品的浸提表面。供試液制備應(yīng)按無菌操作法進(jìn)行，在制備后2h內(nèi)使用。管類器具：按管內(nèi)表面積每10cm2流過管內(nèi)腔1mL浸提介質(zhì)，流量約為10mL/min.5.2.4接種、培養(yǎng)和觀察（1）洗脫液與培養(yǎng)基無菌檢驗(yàn)：無菌試驗(yàn)前3天，于需-厭氧培養(yǎng)基中各接種1ml洗脫液，分別至30~35℃與20~25℃培養(yǎng)72h，應(yīng)無菌生長。（2）陽性對照管菌液制備：試驗(yàn)前一天取金黃色葡萄球菌（CMCC26003）新鮮培養(yǎng)物，接種1環(huán)至需-厭氧培養(yǎng)基內(nèi)，在30~35℃培養(yǎng)16~18h，用0.9％無菌氯化鈉溶液稀釋10cfu/ml備用。取生孢梭菌（CMCC6494）的需氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)物1環(huán)接種于相同培養(yǎng)基內(nèi)，30~35℃培養(yǎng)16~18h，用0.9％無菌氯化鈉溶液稀釋10cfu/ml備用。取白色念珠菌（CMCC98001）真菌瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物1環(huán)，接種于相同培養(yǎng)基內(nèi)，20~25℃培養(yǎng)24h，用0.9％無菌氯化鈉溶液稀釋10cfu/ml~10cfu/ml備用。（3）培養(yǎng)：將需-厭氧培養(yǎng)管以及陽性與陰性對照管均于30～35℃培養(yǎng)5天。霉菌培養(yǎng)管與陰性對照管于20～25℃培養(yǎng)7天。4、根據(jù)供試品具體特性選擇《中國藥典》二部附錄中“無菌檢查法”的規(guī)定的適宜接種方式，以無菌操作法進(jìn)行。供試品的培養(yǎng)和觀察按《中國藥典》二部附錄中“無菌檢查法”的規(guī)定。6.結(jié)果判定按《中國藥典》二部附錄中“無菌檢查法”的規(guī)定。結(jié)果判定為陽性對照在24h內(nèi)應(yīng)有菌生長，陰性對照無菌生長，需-厭氧培養(yǎng)管及霉菌培養(yǎng)管無菌生長，可判為滅菌合格。如需-厭氧培養(yǎng)管及霉菌培養(yǎng)管中任何1管顯混濁并證明有菌生長，應(yīng)重新取樣，分別復(fù)測2次，如各管無菌生長仍可判為滅菌合格。7.試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告中宜給出下列信息：a供試品名稱；b生產(chǎn)批號和（或）滅菌批號；c供試液制備方法；d接種方式；e每日觀察結(jié)果；f結(jié)果判定。附表1:產(chǎn)品無菌檢驗(yàn)報(bào)告8.注意事項(xiàng)：（1）在潔凈度100級區(qū)域中進(jìn)行，嚴(yán)格無菌操作。（2）采樣后送檢時間不得超過6h，樣品保存于4℃，則不超過24h。（3）如消毒因子為消毒劑，采樣液中應(yīng)加入中和劑。（4）采樣面積，100cm2。（5）設(shè)好陽性、陰性