溶劑熱法合成熒光碳點(diǎn)及其性能研究

0熒光碳點(diǎn)生物流體技術(shù)熒光碳點(diǎn)（cds）也被稱為熒光碳納米顆粒，是隨著時(shí)間的推移而產(chǎn)生的一種新型的熒光納米顆粒。與傳統(tǒng)的有機(jī)染料相比,熒光碳點(diǎn)具有穩(wěn)定性高、激發(fā)波長和發(fā)射波長可調(diào)、易于表面功能化、無“光閃爍”現(xiàn)象和抗光漂白性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),引起了人們廣泛的關(guān)注,成為熒光納米材料領(lǐng)域一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。目前,熒光碳點(diǎn)的合成方法主要有電化學(xué)法、濃酸氧化法、激光消融法、有機(jī)物碳化法、模板法等。其中,有機(jī)物碳化法相比于其它方法來說,對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求不高、成本低、碳源豐富、操作簡單。Zhu等報(bào)道了用微波輔助加熱來碳化糖類物質(zhì)以合成熒光碳點(diǎn),目前還未見采用溶劑熱法碳化糖類物質(zhì)制備熒光碳點(diǎn)的報(bào)道。熒光碳點(diǎn)是理想的生物熒光標(biāo)記材料之一,具有廣闊的應(yīng)用前景。目前,已有大量報(bào)道將熒光碳點(diǎn)應(yīng)用于細(xì)胞標(biāo)記,并被認(rèn)為生物相容性好,毒性低,對(duì)細(xì)胞損傷小。另外,熒光碳點(diǎn)既可用于單光子成像,又可用于雙光子成像,有望代替量子點(diǎn)成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最具應(yīng)用前景的環(huán)境友好型熒光納米材料。然而,作為可能短期或長期存在于生物體內(nèi)的熒光探針,熒光碳點(diǎn)是否也如量子點(diǎn)一樣存在潛在的負(fù)面生物效應(yīng),至今還沒有人進(jìn)行過系統(tǒng)的研究。鑒于此,本實(shí)驗(yàn)以真核模式生物-釀酒酵母為研究對(duì)象,系統(tǒng)考察了以葡萄糖為碳源,溶劑熱法合成的熒光碳點(diǎn)對(duì)不同生長時(shí)期釀酒酵母生長的影響,并比較了相同熒光強(qiáng)度條件下熒光碳點(diǎn)與CdTe量子點(diǎn)對(duì)釀酒酵母的細(xì)胞毒性。1實(shí)驗(yàn)部分1.1實(shí)驗(yàn)儀器和儀器碲粉(純度99.999%,中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司);CdCl2·2.5H2O、NaBH4、巰基乙酸、甘氨酸、葡萄糖、乙二醇、NaOH均為分析純?cè)噭?購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;胰蛋白胨購自上海生物工程有限公司;酵母提取物購自BIOBASICINC。釀酒酵母Y45購自中國科學(xué)院沈陽生態(tài)研究所。實(shí)驗(yàn)用水為3次蒸餾水。UV-2000紫外-可見分光光度計(jì)(北京瑞利公司),LS-55熒光分光光度計(jì)(美國PerkinElmer公司),TechnaiF20透射電鏡(荷蘭FEI公司),LeicaDMIL熒光顯微鏡(德國萊卡公司),ZHWY多振幅軌道式恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智誠分析儀器制造有限公司);HPX-9082MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱和YXQ-LS-305Ⅱ全自動(dòng)立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠),DS-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠),所有測試均在室溫下完成。1.2反應(yīng)煙毒反應(yīng)熒光碳點(diǎn)的制備采用溶劑熱法合成:取0.5g葡萄糖溶于25mL乙二醇/水(1∶1V/V)溶液中,并轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中,在180℃下反應(yīng)3h。取出冷卻至室溫后,再加入0.15g甘氨酸粉末于上述反應(yīng)液中,于120℃烘箱中恒溫加熱12h進(jìn)行鈍化,即得到紅褐色的熒光碳點(diǎn)溶液,以碳計(jì)所制備熒光碳點(diǎn)的濃度是0.67mol·L-1。1.3cdte的制備巰基乙酸穩(wěn)定的CdTe量子點(diǎn)采用水熱法合成,參照文獻(xiàn)方法制備略有改動(dòng)。將0.1276g碲粉和0.1211gNaBH4分別倒入反應(yīng)瓶中,注入4.0mL水,在冰水浴和磁力攪拌下進(jìn)行反應(yīng),約4h后得白色混濁液,靜置10min后,得上層無色NaHTe水溶液。向三口燒瓶中加入40mL濃度為0.020mol·L-1CdCl2溶液,并向其中通入N2,再加入0.14mL巰基乙酸,用2.0mol·L-1NaOH溶液將上述溶液的pH調(diào)至11.2~11.8范圍內(nèi),劇烈攪拌下用N2脫氧20min。然后,迅速將上述新制備的NaHTe溶液注入到三口燒瓶中,繼續(xù)攪拌20min,得桔黃色透明CdTe量子點(diǎn)原溶液。取一定量CdTe量子點(diǎn)原溶液加入到聚四氟乙烯反應(yīng)罐中,在140℃烘箱中恒溫加熱90min即得到CdTe量子點(diǎn),以Te2-計(jì)量子點(diǎn)濃度為10mmol·L-1。1.4酵母提取物的制備釀酒酵母培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中所用培養(yǎng)液、錐形瓶、量筒和移液槍槍頭等均在實(shí)驗(yàn)前經(jīng)過0.1MPa,120℃高溫高壓滅菌20min。釀酒酵母Y45的培養(yǎng)基為:葡萄糖,20g·L-1;蛋白胨,20g·L-1;酵母提取物,10g·L-1。取少量斜面種子在100mL錐形瓶(內(nèi)裝培養(yǎng)基10mL)培養(yǎng)基中,旋轉(zhuǎn)式搖床(180r·min-1),溫度28℃條件下,培養(yǎng)24h后取0.1mL接入100mL錐形瓶(內(nèi)有培養(yǎng)基10mL),在相同條件下發(fā)酵30h。釀酒酵母的計(jì)數(shù)采用紫外吸收光度法,即每隔一段時(shí)間從各個(gè)錐形瓶中吸取400μL酵母菌溶液于5mL離心管中,加入2mL蒸餾水稀釋,以蒸餾水作空白,測定600nm處的吸光度值(OD600值),以此判斷釀酒酵母的生長階段及相對(duì)數(shù)量。2結(jié)果與討論2.1熒光碳點(diǎn)圖1為合成的熒光碳點(diǎn)的紫外吸收與熒光發(fā)射光譜譜圖。從圖中可以看出,曲線a在280nm左右處出現(xiàn)了明顯的熒光碳點(diǎn)的特征吸收峰。在345nm波長激發(fā)下,熒光碳點(diǎn)在435nm處得到一個(gè)較強(qiáng)的發(fā)射峰(曲線b),這與在紫外燈下熒光碳點(diǎn)發(fā)射的明亮藍(lán)色熒光(圖1)一致。圖2是該樣品的透射電鏡(TEM)照片,從圖中可以看出,該方法合成的熒光碳點(diǎn)為直徑4~6nm左右的圓形顆粒,分散性好,無團(tuán)聚現(xiàn)象。高分辨電鏡照片(HRTEM)顯示,該碳點(diǎn)晶面間距為0.213nm,與石墨相(100)晶面十分吻合。實(shí)驗(yàn)中還考察了所合成的熒光碳點(diǎn)在不同濃度下熒光強(qiáng)度的變化。如圖3a所示,合成的熒光碳點(diǎn)原液用水稀釋成不同的濃度,并沒有出現(xiàn)發(fā)射峰位的移動(dòng),表明該水相法合成的熒光碳點(diǎn)能夠穩(wěn)定地分散在水溶液中。從圖3b可以看出,隨著碳點(diǎn)溶液的不斷稀釋,熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì),當(dāng)稀釋到60倍的時(shí)候,熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。這可能是因?yàn)楫?dāng)碳點(diǎn)濃度過高時(shí),碳點(diǎn)之間的距離很小,由此產(chǎn)生濃度淬滅現(xiàn)象,使得熒光較弱,因此制得的熒光碳點(diǎn)原液基本沒有熒光(圖中未給出)。當(dāng)稀釋到60倍時(shí)(濃度為11.1mmol·L-1)熒光強(qiáng)度最大,對(duì)熒光的濃度淬滅效應(yīng)基本已經(jīng)不存在,繼續(xù)稀釋溶液,熒光強(qiáng)度就隨著碳點(diǎn)濃度降低而降低。因此理論上認(rèn)為,該濃度為最佳的細(xì)胞標(biāo)記濃度,后續(xù)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)都是在該濃度下進(jìn)行的。2.2釀酒酵母細(xì)胞毒性釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),又稱出芽酵母,它與同為真核生物的動(dòng)物和植物細(xì)胞具有很多相同的結(jié)構(gòu),又容易培養(yǎng),因此常被用作研究真核生物的模式生物。本實(shí)驗(yàn)采用釀酒酵母Y45菌種作為細(xì)胞毒性研究對(duì)象,以此考察合成的熒光碳點(diǎn)對(duì)細(xì)胞生長的毒性作用。釀酒酵母的生長一般有4個(gè)時(shí)期:調(diào)整期,對(duì)數(shù)期,穩(wěn)定期,衰亡期。將釀酒酵母以1%的接種量接種于培養(yǎng)基中,在28℃,180r·min-1下培養(yǎng),定期測定酵母菌的OD600值,得生長曲線如圖4所示。由圖中可知,隨著酵母菌培養(yǎng)時(shí)間的增加,吸光度值逐漸增大,說明培養(yǎng)瓶中的酵母菌細(xì)胞逐漸增多,當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為24h時(shí)吸光度值基本達(dá)到最大,繼續(xù)培養(yǎng),吸光度值基本不發(fā)生變化。具體來說,在培養(yǎng)0~6h時(shí)吸光度值變化不大,說明此時(shí)釀酒酵母處于生長的調(diào)整期;6~24h吸光度值迅速增加,說明此階段細(xì)胞生長最快,為釀酒酵母的生長對(duì)數(shù)期;24h后釀酒酵母的生長基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。2.3中國語境下改造量值技術(shù)量子點(diǎn)是熒光碳點(diǎn)問世之前一種很有發(fā)展?jié)摿Φ男滦蜔晒馍锾结?在生物標(biāo)記和生物檢測領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。然而,隨著研究的深入,量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性效應(yīng)逐漸顯現(xiàn),人們不得不對(duì)量子點(diǎn)的生物應(yīng)用前景進(jìn)行重新審視。作為與量子點(diǎn)類似的熒光碳點(diǎn),也很有必要考察其細(xì)胞毒性。2.3.1熒光碳點(diǎn)對(duì)釀酒酵母的數(shù)量影響根據(jù)釀酒酵母不同的生長階段即在培養(yǎng)2h(調(diào)整期)、6h(對(duì)數(shù)期早期)和12h(對(duì)數(shù)期中期)時(shí)分別加入用培養(yǎng)基稀釋的濃度為11.1mmol·L-1、18.5mmol·L-1、27.75mmol·L-1熒光碳點(diǎn),然后在不同時(shí)間測釀酒酵母的吸光度值并繪制生長曲線。圖5分別為在培養(yǎng)2h、6h和12h時(shí)加入不同濃度碳點(diǎn)溶液后釀酒酵母的生長曲線圖。由圖5a可以看出,在釀酒酵母的調(diào)整期(2h)加入熒光碳點(diǎn),在經(jīng)共培養(yǎng)至10h時(shí),酵母菌的數(shù)量與空白對(duì)照比較有明顯的降低,同時(shí)數(shù)量的降低與熒光碳點(diǎn)的濃度有關(guān),即碳點(diǎn)濃度越高,酵母菌的活性降低越多。由圖中還可以看出碳點(diǎn)對(duì)酵母菌的影響主要體現(xiàn)在生長對(duì)數(shù)期,在這個(gè)階段,熒光碳點(diǎn)的濃度越大,則對(duì)應(yīng)的溶液中的酵母菌數(shù)量越少,表明酵母菌的活性越差,該結(jié)果說明熒光碳點(diǎn)對(duì)處于調(diào)整期的酵母菌具有一定毒性,濃度越高毒性越大。繼續(xù)培養(yǎng),各樣品間酵母菌的數(shù)量差別逐漸減小,當(dāng)培養(yǎng)至30h時(shí),所有樣品的酵母菌數(shù)量幾乎相同,這說明熒光碳點(diǎn)對(duì)酵母細(xì)胞的毒性可通過菌自身的解毒作用消除。當(dāng)在對(duì)數(shù)期早期(6h)加入熒光碳點(diǎn)后(如圖5b所示),與不同濃度碳點(diǎn)的共培養(yǎng)基本沒有改變釀酒酵母的生長曲線,共培養(yǎng)至10h與12h時(shí),各樣品中酵母菌數(shù)量幾乎沒有差異,雖然在24h時(shí)略有差異,但在30h后各樣品中酵母菌數(shù)量幾乎相同。在對(duì)數(shù)期中期(12h)時(shí)加入不同濃度的熒光碳點(diǎn)得到的生長曲線如圖5c所示,從圖中可以看出,加入不同碳點(diǎn)濃度的酵母菌的生長曲線與空白對(duì)照基本一致,酵母細(xì)胞數(shù)量只有微量的下降。表明熒光碳點(diǎn)在一定濃度范圍內(nèi)(<27.75μmol·mL-1)對(duì)釀酒酵母的生長基本不會(huì)產(chǎn)生影響,細(xì)胞毒性低到可以忽略。相對(duì)而言,在酵母菌的調(diào)整期和對(duì)數(shù)期早期時(shí)加入熒光碳點(diǎn)共培養(yǎng),其細(xì)胞毒性要稍微大于在酵母菌對(duì)數(shù)期中期加入熒光碳點(diǎn)共培養(yǎng)的表現(xiàn),因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)主要在釀酒酵母的調(diào)整期(2h)和對(duì)數(shù)期早期(6h)比較熒光碳點(diǎn)和CdTe量子點(diǎn)的毒性。2.3.2熒光碳點(diǎn)與量子點(diǎn)對(duì)釀酒酵母的影響要比較熒光碳點(diǎn)與量子點(diǎn)對(duì)釀酒酵母的細(xì)胞毒性,有必要使得兩種納米發(fā)光材料的熒光強(qiáng)度相同。通過初步實(shí)驗(yàn)測得,當(dāng)熒光碳點(diǎn)的熒光最強(qiáng),即濃度為11.1mmol·L-1時(shí),對(duì)應(yīng)的發(fā)射相同熒光強(qiáng)度CdTe量子點(diǎn)的濃度為16.7μmol·L-1。通過分別考察上述濃度的熒光碳點(diǎn)溶液和量子點(diǎn)溶液與不同生長期釀酒酵母共培養(yǎng)后的生長曲線可知,如圖6所示,在酵母菌生長到2h時(shí)加入熒光碳點(diǎn)(實(shí)線表示)與CdTe量子點(diǎn)(虛線表示)溶液,酵母菌的數(shù)量基本相同。繼續(xù)培養(yǎng)至10h時(shí),加入CdTe量子點(diǎn)的酵母菌數(shù)量與圖4所示的空白對(duì)照相比明顯降低,培養(yǎng)12h后酵母菌數(shù)量只見少量增長,繼續(xù)培養(yǎng)則已不增加酵母菌的數(shù)量,而加入熒光碳點(diǎn)共培養(yǎng)的酵母菌生長沒有受到影響,與空白對(duì)照所示的生長曲線基本相同。從在6h時(shí)加入熒光碳點(diǎn)與量子點(diǎn)所得到的酵母菌生長曲線可以看出,在10h之前二者對(duì)酵母菌生長的影響沒有顯著區(qū)別,細(xì)胞增長數(shù)量基本相同,說明4h內(nèi)毒物對(duì)酵母菌的影響很小。10h后與熒光碳點(diǎn)共培養(yǎng)的酵母菌繼續(xù)生長,與圖4所示空白對(duì)照基本一致,而與量子點(diǎn)共培養(yǎng)的酵母菌數(shù)量已不再增加。以上結(jié)果說明,熒光碳點(diǎn)的加入不影響釀酒酵母的生長,其生物相容性較好,毒性低,而CdTe量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性則相對(duì)較強(qiáng),它的加入改變了釀酒酵母的生長曲線,明顯抑制酵母菌的生長,說明在相同熒光強(qiáng)度下,熒光碳點(diǎn)的細(xì)胞毒性明顯小于CdTe量子點(diǎn)。同時(shí),量子點(diǎn)對(duì)不同生長時(shí)期的酵母菌影響不同,相對(duì)而言,對(duì)調(diào)整期的酵母菌的影響要大于對(duì)數(shù)期的酵母菌。另一方面,量子點(diǎn)對(duì)酵母菌的毒性并不是一開始就產(chǎn)生作用,而是經(jīng)過一段時(shí)間之后才會(huì)發(fā)揮作用,這可能與酵母菌本身對(duì)重金屬離子的解毒機(jī)制有關(guān)。實(shí)驗(yàn)還考察了更高濃度下,熒光碳點(diǎn)和量子點(diǎn)對(duì)釀酒酵母毒性的影響。設(shè)定上述相同熒光強(qiáng)度的熒光碳點(diǎn)(濃度為11.1mmol·L-1)與CdTe量子點(diǎn)(濃度為16.7μmol·L-1)的量為1,繼續(xù)增加熒光碳點(diǎn)和量子點(diǎn)的濃度,于對(duì)數(shù)期早期(6h)加入酵母菌中與之共培養(yǎng),培養(yǎng)30h后測定酵母菌的OD600值,結(jié)果如圖7所示。由圖可見,在熒光碳點(diǎn)溶液的量為2倍、3倍和6倍時(shí)分別只引起了酵母菌數(shù)量2.2%、4.8%、11.9%的降低;相對(duì)應(yīng)的,增加2倍、3倍和6倍的CdTe量子點(diǎn)溶液則分別引起了酵母菌活性50.1%、55.4%、61.2%的降低。證明熒光碳點(diǎn)對(duì)細(xì)胞的毒性很小,即使在很高的濃度下,也只產(chǎn)生了微量的毒性;而相對(duì)來說,CdTe量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性則明顯高于熒光碳點(diǎn)。圖8分別為空白對(duì)照(a)、與熒光碳點(diǎn)(b)以及與量子點(diǎn)(c)共培養(yǎng)24h后釀酒酵母的細(xì)胞形態(tài)顯微照片。與空白相比,與熒光碳點(diǎn)共培養(yǎng)后的釀酒酵母細(xì)胞形態(tài)完好,出芽率相當(dāng),生長正常。而與量子點(diǎn)共培養(yǎng)后的釀酒酵母細(xì)胞雖然在形態(tài)上沒有明顯的改變,但出芽率降低,而且細(xì)胞數(shù)量明顯減少,該現(xiàn)象說明量子點(diǎn)的存在抑制了釀酒酵母的生長。以上結(jié)果表明,熒光碳點(diǎn)的細(xì)胞毒性顯著小于量子點(diǎn)的毒性,即使在很高的濃度(66.6mmol·L-1)下也顯示出很低的細(xì)胞毒性。因此,熒光碳點(diǎn)是一種生物相容性好,細(xì)胞毒性低的新型熒光材料,有望替代量子點(diǎn)成為細(xì)胞標(biāo)記和活體成像的優(yōu)良生物熒光探針,在生命科學(xué)領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景。3熒光碳點(diǎn)對(duì)酵母菌細(xì)胞毒性的影響以葡萄糖為碳源,溶劑熱法合成了發(fā)光穩(wěn)定、熒光強(qiáng)度高、紫外燈下發(fā)藍(lán)光且在水溶液中高分散的熒光碳點(diǎn)。其發(fā)光強(qiáng)度受濃度影響,原溶液稀釋60倍時(shí)熒光強(qiáng)度最大。實(shí)驗(yàn)考察了熒光碳點(diǎn)對(duì)釀