第五章分子生物學研究方法

DNA、RNA及蛋白質操作技術DNA分子的切割與連接核酸分子雜交凝膠電泳細胞轉化核酸序列分析基因的人工合成基因操作基因的定點突變PCR擴增等核心技術分子生物學研究從20世紀中葉開始得到高速發(fā)展，其中最主要的原因就是現(xiàn)代分子生物學研究方法、特別是基因操作和基因工程技術的進步。5.1重組DNA技術回顧——三大成就：1、20世紀40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質，解決了遺傳的物質基礎問題；（1928FrederickGriffith&1944OswaldAveryTransformationofStreptococcuspneumoniae）2、50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結構模型和半保留復制機制,解決了基因的自我復制和世代交替問題。但是：如果沒有分離和富集單一DNA分子的技術，科學家就無法對這類物質進行直接的生化分析。僅僅能在體外利用限制性核酸內切酶和DNA連接酶進行DNA的切割和重組遠不能滿足基因研究的需要。DNA片段在體外不具備自我復制能力，要想得到足夠量和足夠純度的DNA，必須將它們連接到具備自主復制能力的DNA分子上（載體上），并轉入寄主細胞中進行繁殖。這就是基因克隆或分子克隆。1970年，Mandel和Higa發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌細胞經適量氯化鈣處理后，能有效地吸收λ噬菌體DNA。1972年，Cohen等人又報道，經氯化鈣處理的大腸桿菌細胞同樣能夠攝取質粒DNA。從此，大腸桿菌就成了分子克隆中最常用的轉化受體。5.2DNA基本操作技術

5.2.1核酸的凝膠電泳自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術，已經發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質與核酸相互作用的重要實驗手段，也是現(xiàn)在通用的許多分子生物學研究方法。DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性內切酶片段分析以及限制酶切作圖等的技術基礎，受到科學界的高度重視。

1、基本原理一種分子在電場中，它會以一定的速度移向適當?shù)碾姌O。把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。電場強度越大，電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)量越多，其遷移的速度越快，反之則較慢。由于在電泳中用無反應活性的穩(wěn)定的支持介質，如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等，故電泳的遷移率與分子的摩擦系數(shù)成反比。圖3-2：以禽巴氏桿菌C48-3株基因組DNA為模板PCR擴增的

cp39基因M：DNAmarkerofDL1500；1：PCR產物；2：陰性對照。M：標準DNA-DL2000；1：PCRproducts;2：Negativecontrol.圖2-2：體內外培養(yǎng)禽巴氏桿菌莢膜蛋白的SDS結構M：低分子量標準蛋白；1-4：體外培養(yǎng)的X-73，C48-3，P-1059和C51-3株莢膜蛋白；5-8：體內培養(yǎng)的巴氏桿菌X-73，C48-3，P-1059和C51-3株莢膜蛋白。

脈沖電場凝膠電泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE)這種電泳是在兩個不同方向的電場周期性交替進行的。DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應所需的時間取決于它的大小。該方法可分離長至5Mb的DNA分子。嚴格說來，應叫交替電場凝膠電泳。5.2.2細菌轉化與目標DNA分子的增殖細菌轉化（transformation）一種細菌菌株由于捕獲了來自供體菌株的DNA而導致性狀特征改變的過程。提供轉化DNA的菌株叫做供體菌，接受轉化DNA的細菌菌株則被稱為受體菌。感受態(tài)：

細菌能從周圍環(huán)境中吸收DNA的生理狀態(tài)稱為感受態(tài)(competence).

感受態(tài)的出現(xiàn)是由于細菌表面出現(xiàn)許多DNA結合位點，這些位點只能與雙鏈DNA結合，而不與單鏈DNA結合。這說明完整的雙鏈結構對于轉化活性來說是必要的；DNA的進入和整合均為單鏈狀態(tài)。細菌轉化的一種可能機制（1）細菌感受態(tài)的形成（2）轉化子的吸收（3）整合符合物前體的形成（4）單鏈DNA轉化子的整合（5）轉化子的形成

1.

CaCl2誘導大腸桿菌轉化法

Ca2+誘導的完整細胞的轉化適用于革蘭氏陰性細菌.其原理是Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結構，后者經熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現(xiàn)空隙，細菌細胞此時的狀態(tài)叫做感受態(tài)(Competence)。(a)在0℃的CaCl2低滲溶液中，細菌細胞發(fā)生膨脹，同時Ca2+

使細胞膜磷脂層形成液晶結構，促使細胞外膜與內膜間隙中的部分核酸酶解離，形成感受態(tài)。(b)Ca2+

與DNA分子結合，形成抗DNase的羥基－磷酸鈣復合物，并粘附在細菌表面。(c)當42℃熱刺激短暫處理細菌細胞時，細胞膜的液晶結構發(fā)生劇烈擾動，并隨之出現(xiàn)許多縫隙，為DNA分子提供了進入細胞的通道。CaCl2誘導法的可能機制大腸桿菌感受態(tài)細胞的質粒轉化（1）取100μl感受態(tài)細胞，加入相當于50ng載體的重組DNA連接液，混勻；（2）冰浴放置半小時；（3）在42℃保溫2分鐘（熱脈沖）；（4）快速將轉化細胞轉移至冰浴中放置1-2分鐘；（5）加入1ml新鮮培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)1小時；（6）涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進行篩選。轉化率：5×106~2×107個轉化子/ug質粒將待轉化的質?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。在強大電場的作用下，細菌細胞壁和細胞膜產生縫隙，質粒或DNA重組分子便可進入細胞內。電穿孔轉化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻毎诮Y構的受體細胞均有效，但轉化效率差別很大。2.電擊法轉化大腸桿菌:

優(yōu)化參數(shù)—電場強度、電脈沖長度、

DNA的濃度。轉化率：109-1010轉化子/μgDNA.電穿孔轉化儀感受態(tài)細胞轉化率：轉化體總數(shù)=菌落數(shù)×（轉化反應總體積/涂板菌液體積）插入頻率=白色菌落數(shù)/（白色菌落數(shù)+藍色菌落數(shù)）轉化頻率=轉化體總數(shù)/加入質粒DNA總量（ug）5.2.3聚合酶鏈式反應

PolymeraseChainReaction(PCR)1.PCR的定義在引物指導下由酶催化的對特定克隆或基因組DNA序列進行的體外擴增反應。2.PCR技術的優(yōu)點（1）特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等；（2）能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內擴增至十萬乃至百萬倍。3.PCR技術原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。模板DNA變性：加熱至94℃左右，雙鏈DNA解離成單鏈；模板DNA與引物的退火(復性)：55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；引物的延伸：在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP為原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的雙鏈；重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。PCR過程（1）denaturatation（2）Primerannealing（3）PrimerextensionPCRproductPCR反應曲線4.PCR的標準反應體系10×PCR緩沖液10μl

4種dNTP混合物各200μmol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2μg

TaqDNA聚合酶2.5U

Mg2+

1.5mM

無菌D.W

100ul5.PCR反應五要素primerTaqDNApolymerasedNTP:dATP、dGTP、dCTP、dTTP

TemplateDNA

Mg2+（1）引物A.引物是PCR特異性反應的關鍵;B.PCR產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度.引物設計的原則①引物長度：15-30個堿基，常為20個堿基左右;②引物擴增跨度：以500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段;③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,ATGC最好隨機分布.④避免引物內部出現(xiàn)二級結構避免兩引物間互補，特別是3`端⑤引物3`端的堿基要求嚴格配對特別是最末及倒數(shù)第二個堿基⑥引物中可以加上合適的酶切位點要作酶切時加⑦引物的特異性引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性（2）酶濃度A.

TaqDNA聚合酶注：無3`→5`方向的校正活性B.一個典型的PCR反應約需酶量2.5U。濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。（3）dNTP的質量與濃度dNTP質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系。A.dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解；B.在PCR反應中，dNTP應為20～200μM，注意4種dNTP的濃度要相等。（4）模板DNA模板DNA的含量與純度，是PCR成敗的關鍵環(huán)節(jié)之一。（5）Mg2+濃度A.Mg2+對擴增特異性和產量有顯著影響:

Mg2+濃度過高，反應特異性降低；濃度過低會降低TaqDNA聚合酶活性，使反應產物減少。B.在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200μM時，Mg2+濃度為1.5-2mM為宜。6.PCR熱循環(huán)條件的選擇PCR反應條件:溫度時間循環(huán)次數(shù)(1)溫度與時間的設置●設置變性-退火-延伸三個溫度點：

1）93-95℃變性

2）40-60℃退火

3）70-75℃延伸●對于較短靶基因（長度為100～300bp時）可采用二溫度點法，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（2）循環(huán)次數(shù)●決定PCR擴增程度

●主要取決于模板DNA的濃度

●選在25～40次之間（3）延伸溫度與時間A.延伸溫度：一般在70～75℃之間，常用溫度為72℃；B.延伸反應時間：根據(jù)待擴增片段長度而定,1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min。注意：

A.延伸時間過長會導致非特異性擴增；B.對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。（4）引物的復性溫度

當引物長度為15-20個堿基時，在高離子強度中反應（如1MNaCl）。

Tm=4（G+C）+

2（A+T）復性溫度=Tm值-（5～10℃）復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合7.PCR技術的應用（1）基因組中特異片段克?。?）RT-PCR（3）基因的體外誘變（4）基因組的比較研究5.2.4實時定量PCR（RealtimequantitativePCR）建立實時定量PCR技術的必要性常規(guī)PCR：可擴增特定核苷酸片斷；用凝膠電泳可檢測PCR擴增產物（定性）；同位素標記及光密度掃描技術可檢測PCR產物量（定量）。研究證明：PCR產物總量變異系數(shù)常常達到10%-30%。但是我們所感興趣的是未經PCR信號放大之前的起始模板量。如我們想知道某一轉基因動植物轉基因的拷貝數(shù)或者某一特定基因在特定組織中的表達量。在這種需求下實時定量PCR技術應運而生。熒光定量PCR的原理PCR擴增呈指數(shù)增長，在反應體系和條件完全一致的情況下，樣本DNA含量與擴增產物的對數(shù)成正比，由于反應體系中的熒光染料或熒光探針與擴增產物結合發(fā)光，其熒光量與擴增產物量成正比，因此通過熒光量的檢測就可以測定樣本核酸量。實時定量PCR和常規(guī)PCR的區(qū)別（1）常規(guī)PCR是通過瓊脂糖電泳對擴增反應的最終產物進行定性分析（定量不準確）；（2）熒光定量PCR是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，使每一個循環(huán)變得“可見”，通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA或cDNA的起始濃度進行定量的方法（準確定量）。Non-specificDNAbindingdyes:-SYBR?GreenI-SYBR?Gold-EthidiumBromide非特異性嵌入熒光染料評價優(yōu)點：與特異性的熒光探針相比價格便宜只需要設計PCR引物缺點：由于它和模板的結合是非特異性的，它可以和所有的雙鏈DNA包括引物和非特異性擴增產物結合，不能真實反映目的基因的擴增情況。特異性熒光探針將特異性寡核苷酸被熒光素標記，制備熒光標記的DNA探針。通過探針與PCR產物特異性的結合，可均相、實時定量檢測在整個PCR過程中產量。TaqMan探針：一段5’端標記報告熒光基團(R)，3’端標記猝滅熒光基團(Q)的寡核苷酸，其序列與模板DNA中的一段完全互補。當探針單獨存在時，由于熒光共振能量轉移的發(fā)生,R熒光受到Q的猝滅。在PCR過程中，由于TaqDNA酶的5’→3’外切酶活性的作用，使探針的5’端的R被切除，加大了與Q的距離而使熒光恢復。隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。因此，Taqman探針檢測的是積累熒光。TaqMan探針評價優(yōu)點：熒光信號強與其它探針相比設計簡單可用于多通道檢測

缺點：比DNA結合染料價格高（ThresholdCycle，Ct）閾值在PCR擴增過程中擴增產物熒光信號超過基線值或進入指數(shù)增長期時的循環(huán)數(shù)。熒光擴增曲線可分3個階段熒光背景信號階段：擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化。熒光信號指數(shù)擴增階段：PCR產量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系，可以選擇在這個階段進行定量分析。平臺期：擴增產物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR終產物量與起始模板量間無線性關系，所以根據(jù)最終的PCR產物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。5.2.5基因組DNA文庫的構建基因組文庫：含有某種生物全部遺傳信息的重組DNA分子(克隆)的總和基因組文庫特點：由于基因組文庫來自于某一物種的基因組，而該物種所有組織中的基因組均相同，所以基因組文庫具有種屬特異性，無組織特異性。cDNA文庫—cDNA文庫來自于某一物種某種組織的mRNA，所以cDNA文庫既有種屬特異性，也有組織特異性。基因組文庫的大小理論值:基因組文庫的克隆數(shù)目＝基因組DNA總長/DNA插入片段的平均長度。例如：細菌基因組DNA總長度=3×106kb

酶切后的DNA片段平均長度=15kb

基因組文庫的克隆數(shù)=3×106kb/15kb=2×

105個克隆經驗值：N—基因組文庫克隆總數(shù)P—在基因組文庫中目的基因DNA片段的出現(xiàn)概率f—插入片段大小與基因組DNA大小比值N=Ln(1–P)Ln(1–f)例如：基因組文庫中含目的基因DNA片段的出現(xiàn)概率達到99%，即P=0.99。N=Ln(1–0.99)Ln(1–15/3×106)=9×106經驗值比理論值越大4.5倍5.3RNA基本操作技術真核生物基因組DNA非常龐大，而且含有大量重復序列，無論用電泳分離還是用雜交方法都難以直接分離到靶基因片段。

cDNA則來自反轉錄的mRNA，不含冗余的序列，通過特異性探針篩選cDNA文庫，可以較快地分離到相關基因。5.3.1總RNA的提取

總RNA包括：mRNA，rRNA，tRNA以及sRNA。動物細胞：約含10-5ug/細胞

totalRNA：rRNA—80%~85%tRNA以及sRNA—15%~20%mRNA—1%~5%總RNA的抽提方法常用的方法：異硫氰酸胍-苯酚抽提法迅速破壞細胞結構，使存在于細胞質和細胞核中的RNA釋放出來并使核糖體蛋白與RNA分子分離，還能保證RNA的完整。RNA濃度和純度測定：

OD260=1，RNA濃度為40ug/ml；

OD260/OD280=1.8~2.0，RNA純度較好；

OD260/OD280〉1.8，蛋白質或酚污染。RNA的瓊脂糖電泳檢測：變性條件下進行瓊脂糖電泳，因為RNA易形成二級結構而且易降解。常用變性劑是有甲醛、尿素等。5.3.2mRNA的純化根據(jù)真核細胞mRNA的結構特征來純化mRNA。5.3.3cDNA的合成

cDNA合成包括第一鏈和第二鏈的合成。以mRNA為模板，用oligodT和反轉錄酶合成第一條cDNA。用RNaseH

切割mRNA-cDNA雜合鏈中的mRNA成小片段后，以第一條cDNA為模板，用DNA聚合酶合成出第二條cDNA。5.3.4cDNA文庫的構建由于cDNA的長度一般在0.5~8kb，常用的質粒載體和噬菌體載體都能滿足要求。cDNA文庫載體選擇要根據(jù)該文庫的用途來確定。例如：Uni-zapXR載體是一種λ噬菌體載體，具有噬菌體的高效性和質粒載體系統(tǒng)可利用藍白色篩選的便利，可容納10kbDNA插入片段，重組載體通過體內剪切反應（invivoexcision）將cDNA插入片段轉移到質粒系統(tǒng)中，克隆和序列分析。5.3.5基因文庫的篩選通過某種特殊方法從基因文庫中鑒定出含有目的基因片段的特定克隆的過程。核酸雜交法用放射性同位素標記的特異DNA探針適用于高密度的菌落雜交篩選。2.PCR篩選法

PCR篩選法與核酸雜交法具有同樣的通用性，而且操作簡便，但前提是已知足夠的序列信息并獲得基因特異性引物。3.免疫篩選法

免疫篩選法是基于抗原-抗體特異性結合的原理，所以該法適用于表達型文庫的篩選。5.4SNP的理論與應用單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）是指基因組DNA序列中單核苷酸（A、T、C和G）的變異所引起的DNA序列多態(tài)性?；蚪MDNA同一位點上的堿基類叫做一個等位位點。SNP是基因組中最簡單、最常見的多態(tài)性形式，具有很高的遺傳穩(wěn)定性。5.4.1SNP的概述一個SNP表示在基因組DNA某個位點上一個核苷酸的變化，這種變化可能是轉換（C?T，在其互補鏈上則為G?A），也可能是顛換（C?A，G?T，C?G，A?

T），具有轉換型變異的SNP約占SNP總量的2/3左右。

SNP廣泛存在于人類基因組中，其發(fā)生頻率約為1%或更高。據(jù)估計，人類DNA中每300~1000bp就有一個SNP，因此，一個人類個體大約攜帶300萬~1000萬個SNPs。位于染色體上某一區(qū)域的一組相關聯(lián)的SNP等位位點被稱作單倍型（haplotype），相鄰SNPs的等位位點傾向于以一個整體遺傳個后代。例如：玉米儲藏蛋白的8個基因型共包含了3個單倍型(H1，H2和H3)，它們分別由多個相鄰的SNP所構成。H2H15.4.2SNP的檢測技術限制性酶切片段長度多態(tài)性（RFLP）、PCR-單鏈構象多態(tài)性（PCR-SSCP)、毛細管電泳和變性高效液相色譜（DHPLC）等。由于這些技術都必須通過凝膠電泳進行分析，通量受到限制。且這些方法僅能判斷SNP的有無而不能知道確切的堿基類型，只要進行DNA測序分析才能確認所發(fā)現(xiàn)的SNP。基因分型（genotyping）：利用數(shù)據(jù)庫中已有的SNP進行特定人群的序列和發(fā)生頻率的研究，包括基因芯片技術、Taqman技術、分子信標技術（molecularbeacon）和焦磷酸測序法等。1.基因芯片技術（Genechip）

固相支持介質上進行雜交和原位熒光檢測的一種高通量SNP分析方法。通過優(yōu)化芯片雜交程度，使探針只與完全互補的序列能雜交，而不能與含有錯配的堿基的序列雜交。待測基因樣品經PCR擴增及熒光化學標記后與固定的探針進行雜交。

由于目標基因和探針雜交的程度與熒光強度及種類相關，因此通過熒光掃描，可根據(jù)熒光強弱或熒光的種類檢測出被檢序列的堿基類別?；蛐酒夹g固體平面(玻片、尼龍薄膜)DNA樣品微點的排列DNA/DNAorDNA/RNA堿基配對原則熒光標記的探針cDNA芯片制備、工作過程cDNA文庫vectorPCR96-wellplate雜交、洗滌、掃描…………….…………….……