家兔fgf5基因外顯子的遺傳調(diào)控研究

對于需要毛的動物來說，它具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。而動物毛被的生長是一個復(fù)雜的過程,受到一系列因素的影響,并且至今沒有一個恰當(dāng)?shù)睦碚搧斫忉尡幻L的調(diào)控機理。不同品種、不同個體表現(xiàn)出的周期性生長的差異表明,遺傳因素是毛被生長調(diào)控的重要因子,而環(huán)境、營養(yǎng)都需要通過體內(nèi)生理狀況的改變而起作用,即依賴于相關(guān)基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯、產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)而進(jìn)行表達(dá),并在一定條件下對其產(chǎn)物進(jìn)行調(diào)控。尋找影響毛質(zhì)性狀的候選基因一直是眾多研究的目標(biāo)。目前有關(guān)影響毛質(zhì)性狀的相關(guān)因子的研究主要集中于人和小鼠,而關(guān)于影響產(chǎn)毛動物(如長毛兔)毛質(zhì)性狀的相關(guān)因子的研究很少,大大制約了產(chǎn)毛動物育種的發(fā)展。成纖維細(xì)胞生長因子5(fibroblastgrowthfactor5,FGF5)屬成纖維生長因子家族成員之一,是一類自旁分泌性、多功能性生物活性肽。對小鼠的研究表明,有70多種基因突變影響被毛形態(tài),許多突變對被毛的長度無影響,有些使被毛變短,到目前為止僅發(fā)現(xiàn)一種突變引起被毛變長。這一突變最初被命名為go基因突變,后來的試驗證明安哥拉鼠是由FGF5突變引起的,進(jìn)一步的試驗研究表明FGF5是影響毛囊周期性活動及被毛生長的重要生長因子。兔毛生長發(fā)育過程與毛囊/毛乳頭有著密切的聯(lián)系,而FGF5是唯一通過影響毛囊生長期的長短從而影響被毛長度的調(diào)控因子。國內(nèi)外對與產(chǎn)毛性狀相關(guān)基因的研究很少,家兔作為經(jīng)濟(jì)動物在分子遺傳方面的研究更少,本研究以5個家兔群作為試驗材料,對其FGF5基因外顯子進(jìn)行遺傳變異檢測,以期找到與毛質(zhì)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記,為家兔毛質(zhì)性狀選育工作提供一定參考。1材料和方法1.1海兔、九疑山兔和毛兔來源選取5個群體共585只家兔作為試驗材料。其中,60只閩西南兔來自福建省農(nóng)科院,143只海貍色獺兔和101只白色獺兔來自浙江余姚兔場,72只九疑山兔來自湖南省寧遠(yuǎn)縣九疑山兔原種場,209只皖江長毛兔來自江蘇宜興拉必得兔場。所有個體均為隨機抽樣,耳緣靜脈采血5mL,并采用酚/氯仿的方法進(jìn)行總DNA提取。1.2fgf5基因設(shè)計5對特異性引物,對兔FGF5基因全部CDS序列進(jìn)行了掃描。FGF5-1A用于擴(kuò)增家兔FGF5基因5’端及部分外顯子1序列,FGF5-1B擴(kuò)增余下外顯子1序列,FGF5-2用于擴(kuò)增整個外顯子2部分序列,FGF5-3A擴(kuò)增部分內(nèi)含子2和外顯子3序列,FGF5-3B則用于擴(kuò)增外顯子3剩余序列。引物由上海生工生物公司合成。引物序列如表1。1.3酶和主要試劑DNA聚合酶和dNTP均購自寶生物工程(大連)有限公司。EarⅠ和TaqⅠ酶購自寶生物工程(大連)有限公司。1.4pcr和taq酶檢測PCR擴(kuò)增總體積為20μL:1μLDNA模板(100ng/μL),2μL10×PCRBuffer,1.5μLdNTPs(10mmol/L),上下游引物各1μL(10pmol/μL),Taq酶0.2μL(5u/μL),ddH2O13.3μL。PCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性5min;94℃變性40s,適宜溫度退火40s,72℃延伸40s,35個循環(huán),最后72℃延伸10min。1.5rflp技術(shù)引物FGF5-1A和FGF5-3B擴(kuò)增產(chǎn)物分別用EarⅠ和TaqⅠ酶通過RFLP技術(shù)進(jìn)行酶切。而FGF5-1B、FGF5-2、FGF5-3A引物的擴(kuò)增產(chǎn)物則采用SSCP技術(shù)進(jìn)行分析,由上海生物工程有限公司進(jìn)行雙向測序。1.6序列比對和突變位點篩查統(tǒng)計基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量(PIC)、期望雜合度(He),并對各群體基因型分布差異進(jìn)行卡方檢驗,Align軟件進(jìn)行序列比對和突變位點的篩查。若PIC<0.25,則該群體為低度多態(tài);若0.25≤PIC≤0.50,則該群體為中度多態(tài);若PIC>0.50,則該群體為高度多態(tài)。若P值>0.05,則認(rèn)為該群體處于Hardy-Weinberg平衡。若P值<0.05,則認(rèn)為該群體不處于Hardy-Weinberg平衡。2結(jié)果與分析2.1研究發(fā)現(xiàn)fgf5-3b的表達(dá)用5對特異性引物擴(kuò)增家兔FGF5基因,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,擴(kuò)增片段長度與預(yù)期大小一致,且特異性較好。其中,FGF5-1A和FGF5-3B檢測到了變異位點。FGF5-1A的PCR產(chǎn)物經(jīng)RFLP檢測后發(fā)現(xiàn)3種基因型(A1A1、A1A2和A2A2型)(圖1)。A1等位基因經(jīng)酶切后得到3個片段,分別是79bp、127bp和143bp;A2等位基因經(jīng)酶切后得到2個片段,分別是79bp和267bp。A2等位基因在模板序列285~287位點存在TCT缺失(geneID:100316906)(圖2),從而導(dǎo)致所編碼的多肽鏈68位點缺失一個絲氨酸(proteinID:XP_002717035.1)。將FGF5-3B擴(kuò)增出的產(chǎn)物經(jīng)RFLP檢測后發(fā)現(xiàn)2種基因型(B1B1和B1B2型)(圖3)。B2等位基因經(jīng)酶切后得到2個片段,分別是57bp和231bp。A2等位基因在模板序列19054位點存在T→C突變(GeneID:100316906)(圖4),從而導(dǎo)致所編碼的多肽序列201位點一個Leu變?yōu)镾er(proteinID:XP_002717035.1)。2.2不同家兔群體的ssc-pcr擴(kuò)增結(jié)果所檢測的群體中,FGF5-1A的3種基因型只有在海貍色獺兔和白色獺兔群體中同時被發(fā)現(xiàn),閩西南兔和九疑山兔群體均檢測到A1A1、A1A2基因型,而皖系長毛兔群體只檢測到A1A1基因型,且5個家兔群體均處于哈代-溫伯格平衡(表2)。獺兔群體表現(xiàn)為中度多態(tài),其中,有色獺兔的期望雜合度和多態(tài)信息含量最高,分別為0.327和0.274。肉兔群體表現(xiàn)為低度多態(tài),毛兔無多態(tài)。由表3可知,皖系長毛兔基因型分布與其他4個家兔群體之間均存在極顯著差異(P<0.01),九疑山兔與海貍色獺兔之間分布差異顯著(P<0.05),其他群體間分布差異不顯著(P>0.05)。FGF5外顯子2的長度約為100bp,本研究中所進(jìn)行擴(kuò)增的引物涵蓋了其整個外顯子2序列,但是未檢測到突變位點。FGF5-3A和FGF5-3B兩對引物均發(fā)現(xiàn)了同一突變位點,即在FGF5-3B擴(kuò)增產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了T19054C突變(圖4),Leu突變?yōu)镾er。但FGF5-3A的SSCP分析中,其構(gòu)象差異不大,并未能發(fā)現(xiàn)其條帶的差異,而FGF5-3B在膠圖上只分辨出2種基因型,即有一種基因型無法區(qū)分,因此對于該區(qū)段未進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。這與李春笑等的試驗結(jié)果相同,他的研究中也未能發(fā)現(xiàn)19054位點堿基同為CC的純合子基因型。3家兔fgf5基因外顯子的多態(tài)性分析近年來,FGF5基因?qū)κ蟊幻绊懙难芯枯^為深入。有研究證明該基因的突變對被毛的長度有顯著影響,并檢測到該基因在皮膚毛囊的表達(dá),同時用體外注射蛋白產(chǎn)物進(jìn)一步驗證了FGF5的蛋白產(chǎn)物對不同時期毛囊生長具有一定的影響。之后,有人對不同品種的綿羊、山羊、狗和貓等動物群體進(jìn)行了FGF5基因的序列分析,發(fā)現(xiàn)多處突變位點,并通過相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)這些突變位點與毛發(fā)的長度有關(guān)。而本研究在進(jìn)行序列分析后,在FGF5基因外顯子1發(fā)現(xiàn)一處TCT(絲氨酸)插入/缺失,此處的插入/缺失可能造成氨基酸序列一個絲氨酸的缺失;在外顯子3發(fā)現(xiàn)一處T→C突變,可能造成氨基酸序列一個亮氨酸變?yōu)橐粋€絲氨酸,有可能改變了蛋白質(zhì)或是多肽的部分功能,影響了兔毛生長周期的某個或者幾個階段,使得兔毛長得更長。本研究對家兔FGF5外顯子區(qū)域進(jìn)行多態(tài)性分析。經(jīng)比對發(fā)現(xiàn),該基因CDS序列與其他哺乳動物間的同源性較高,與豬、牛、人、小鼠間的同源性分別為88%、90%、92%和86%。在本試驗所選的5個家兔群體的FGF5基因外顯子1中,A1等位基因均為優(yōu)勢等位基因,在皖系長毛兔群體中未發(fā)現(xiàn)A2等位基因,可能是由于A1等位基因決定了長毛兔的長毛這種表型,也可能是在長期的選育過程中造成了A2等位基因的流失;FGF5基因外顯子3中,只發(fā)現(xiàn)了2種基因型,