蛋白質(zhì)組學研究中質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組學是一個全面的過程，研究了細胞中蛋白質(zhì)的組成、活動規(guī)律以及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。這是功能因素研究時代的一門新學科。目前蛋白質(zhì)組學的研究主要有兩條路線:一是基于雙向電泳的蛋白質(zhì)組學;二是基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學,其中基于雙向電泳的蛋白質(zhì)組學研究路線最終也離不開質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用。自20世紀80年代末,兩種質(zhì)譜軟電離方式即電噴霧電離(electrosprayionization,ESI)和基質(zhì)輔助激光解析離子化(matrixassistedlaserdesorptionionization,MALDI)的發(fā)明和發(fā)展解決了極性大、熱不穩(wěn)定蛋白質(zhì)和多肽分析的離子化和分子質(zhì)量大的測定問題,蛋白質(zhì)組學研究中常用的質(zhì)譜分析儀包括離子阱(iontrap,IT),飛行時間(timeofflight,TOF),串聯(lián)飛行時間(TOF-TOF),四級桿/飛行時間(quadrupole/TOFhybrids),離子阱/軌道阱(IT/orbitraphybrid)和離子阱/傅里葉變換串聯(lián)質(zhì)譜分析儀(IT/Fouriertransformioncyclotronresonancemassspectrometershybrids,IT/FTMS),這些質(zhì)譜儀具有不同的靈敏度、分辨率、質(zhì)量精確度和產(chǎn)生不同質(zhì)量的MS/MS譜。質(zhì)譜作為蛋白質(zhì)組學研究的一項強有力的工具日趨成熟,并作為樣品制備及數(shù)據(jù)分析的信息學工具被廣泛地應(yīng)用。因此,有學者指出質(zhì)譜技術(shù)已在蛋白質(zhì)組學研究中處于核心地位。目前在通量及所包含的分子信息內(nèi)容上,基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學技術(shù)在細胞生物學研究中可以鑒定和量化特定細胞生命過程中的功能性分子,例如質(zhì)譜技術(shù)可在一次研究中鑒定幾千個蛋白質(zhì)分子,并可以給出蛋白質(zhì)存在的分子修飾狀況;質(zhì)譜分析還可以用于了解蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。因此,有學者認為基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學最終可以進行整個生物系統(tǒng)的蛋白質(zhì)表達水平的研究,并認為蛋白質(zhì)組學可以成為“新基因組學”。筆者主要綜述質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學的應(yīng)用。1質(zhì)譜定量測定蛋白質(zhì)組學最初的研究焦點是蛋白質(zhì)的鑒定,最近基于質(zhì)譜發(fā)展起來的平臺有利于研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)組分數(shù)量變化。在整體水平上研究蛋白質(zhì)的定量分析被稱為定量蛋白質(zhì)組學(quantitativeproteomics),對于系統(tǒng)地理解每個蛋白質(zhì)組分的分子功能有著重要的作用,將為各種生物學過程和生物系統(tǒng)提供新的見解。蛋白質(zhì)組是復雜多變的,即使在一個細胞中不同生理或病理條件下,蛋白質(zhì)的表達也不相同。目前質(zhì)譜越來越多地被用于蛋白質(zhì)或肽的相對或絕對定量的研究。典型的基于質(zhì)譜定量蛋白質(zhì)組學研究可用質(zhì)譜譜圖特征(譜峰的強度,質(zhì)/荷比和出峰的時間)、肽的特征(來源相同肽離子的質(zhì)量同位素峰)、或肽(相同肽不同電荷狀態(tài)的多個肽特征)來表示。定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)可以分為兩類,即標記定量技術(shù)和非標記定量技術(shù)。定量蛋白質(zhì)組學研究的目的是通過比較多個樣品質(zhì)譜相關(guān)信息的豐度變化進行定量,且通過控制假陽性率(false-discoveryrate,FDR)提供差異豐度特征的最大程度列表。定量蛋白質(zhì)組學工作流程可分為3類,即穩(wěn)定同位素標簽、譜峰計算和譜峰特征分析。1.1體外標記技術(shù)穩(wěn)定同位素標簽是一種標記定量技術(shù),用穩(wěn)定同位素標記蛋白質(zhì)樣品﹑混合樣品﹑酶解、質(zhì)譜分析,并分為體內(nèi)標記技術(shù)和體外標記技術(shù)。例如體內(nèi)標記技術(shù)穩(wěn)定同位素標記氨基酸細胞培養(yǎng)(stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture,SILAC),在培養(yǎng)介質(zhì)中加入穩(wěn)定同位素標記的氨基酸進行蛋白質(zhì)的鑒定和定量,但是該技術(shù)只能對可培養(yǎng)的樣品進行定量分析。體外標記技術(shù)同位素標記的親和標簽(isotope-codedaffinitytag,ICAT)是利用ICAT試劑在體外標記不同狀態(tài)蛋白質(zhì)樣品中的半胱氨酸,酶解后用親和柱分離純化標記的肽段再進行質(zhì)譜分析,比較適合兩個樣品的定量比較。隨后又出現(xiàn)了多重元素體外標記技術(shù)如同位素標記相對和絕對定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation,iTRAQ),可對4~8種不同的樣本同時進行定量分析。由于外源試劑的引入使得質(zhì)量發(fā)生變化,因此需在相同的質(zhì)譜運行條件下對肽的譜特征分別定量,譜峰的信號強度可作為定量的依據(jù)。標記技術(shù)準確﹑靈敏,但也存在著標記反應(yīng)復雜及對標記穩(wěn)定同位素的成對質(zhì)量峰的區(qū)分需要更高分辨率的質(zhì)譜儀器等缺點。1.2相對豐度的檢測基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學研究也可用無同位素標記的方式進行定量研究,優(yōu)點在于試驗簡單、不需要同位素標記﹑動態(tài)范圍大。該策略中比較的樣品要分別用質(zhì)譜進行分析,但要用相同的數(shù)據(jù)采集提取步驟,并以肽段被質(zhì)譜檢測的計數(shù)為基礎(chǔ),再通過歸一化來表征被檢測蛋白質(zhì)的相對豐度。質(zhì)譜檢測計數(shù)法認為肽段在質(zhì)譜中被檢測到的頻率與其在混合物中的豐度成正比,因此,蛋白質(zhì)被質(zhì)譜檢測的計數(shù)體現(xiàn)了蛋白質(zhì)的豐度。相對于標記定量蛋白質(zhì)組學研究方法來說,質(zhì)譜檢測計數(shù)法存在對低豐度蛋白質(zhì)的定量準確性低的缺點,但該方法仍具有廣泛的應(yīng)用前景。1.3基于質(zhì)譜的無標記定量技術(shù)譜特征分析法法的工作流程與穩(wěn)定同位素標簽及質(zhì)譜檢測計數(shù)不同,定量前不需要肽序列的鑒定。無標記的定量蛋白質(zhì)組學研究策略中,生物學樣品分別單獨運行質(zhì)譜,通過計算機工具建立特征譜,如肽段峰強度、峰面積、液相色譜保留時間等信息進行蛋白質(zhì)豐度的定量。該項技術(shù)允許分析大量的譜特征和高通量的數(shù)據(jù),因此適合多重樣品分析,缺點是由于大量雜散的特征和噪音增加了計算的復雜性及在不同數(shù)據(jù)采集過程中要求嚴謹性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性?；谫|(zhì)譜的無標記定量蛋白質(zhì)組學具有廣泛的應(yīng)用前景,但內(nèi)在的偏差和數(shù)據(jù)的變異等給定量帶來了巨大的挑戰(zhàn)。最近有學者開發(fā)和測試了一種歸一化的無標記定量方法,即歸譜指數(shù)法(normalizedspectralindex,SIN),整合了質(zhì)譜豐度的3個表征:肽計數(shù)、譜計數(shù)和片段離子的強度。SIN能夠在很大程度上消除重復質(zhì)譜分析所帶來的變異,而且使得定量具有重復性及可量化相同或不同樣品的重復質(zhì)譜分析所得的上千個蛋白質(zhì)。2翻譯后修飾的調(diào)控蛋白質(zhì)的翻譯后修飾控制著基因型和表型的許多生物學過程,據(jù)不完全統(tǒng)計,已知有300多種翻譯后修飾參與生理過程。因此,研究翻譯后修飾的多樣性,對理解細胞水平、生物體水平的表型建成、調(diào)節(jié)機制等十分關(guān)鍵。質(zhì)譜是研究蛋白質(zhì)化學修飾的關(guān)鍵技術(shù),可以定位修飾位點﹑定量化學修飾蛋白及檢測新型結(jié)構(gòu)。翻譯后的修飾種類很多,如磷酸化、乙?；⒎核鼗鞍腚装彼嵫趸?。2.1段離子的質(zhì)量遷移蛋白質(zhì)磷酸化是細胞調(diào)控和信號傳導的關(guān)鍵機制。據(jù)估計,在真核細胞中約有1/3的蛋白質(zhì)通過蛋白質(zhì)激酶和磷酸化酶活性調(diào)節(jié)發(fā)生了磷酸化修飾。蛋白質(zhì)磷酸化是增加了HPO3基團,可通過增加80u的氨基酸殘基質(zhì)量數(shù)來檢測,磷酸位點的檢測可通過磷酸化肽片段離子的質(zhì)量遷移來鑒定。翻譯后修飾的離子特征可用一級質(zhì)譜或串聯(lián)質(zhì)譜掃描監(jiān)測,對于MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)磷酸化可對比前后圖譜,尋找質(zhì)量數(shù)變化為80u或98u及強度增大的信號,則可能是磷酸化肽段。以ESI為離子源的質(zhì)譜在磷酸化肽段檢測中具有廣泛的應(yīng)用前景,通過前體離子掃描和中性丟失掃描來檢測磷酸化肽段。蛋白質(zhì)磷酸化的質(zhì)譜分析主要集中在兩方面:一是磷酸化肽段的尋找;二是磷酸化位點和磷酸化數(shù)量的確定,其中磷酸化位點的確定是肽段磷酸化分析的難點。磷酸化蛋白質(zhì)是一些低豐度蛋白質(zhì),因此,富集磷酸化蛋白是磷酸化蛋白質(zhì)組學的前提。目前富集磷酸化蛋白和肽段的方法主要利用抗體富集和化學方法修飾改變磷酸基團的特異性分離純化,如IMAC固定金屬螯合親和層析,隨著該富集方法的改進,為磷酸化蛋白質(zhì)組學研究提供了更廣泛的研究前景。2.2乙?；牡母患嚢彼幡?氨基和氨基酸N端的乙?；瘜φT導活化裂解產(chǎn)生的肽片段是穩(wěn)定的,并且可通過與未修飾的形式比對特征性的+42.01u質(zhì)量偏移進行檢測。盡管三甲基賴氨酸與乙酰賴氨酸的質(zhì)量相似,但它們的結(jié)構(gòu)可以通過高分辨率的質(zhì)譜進行辨別。由于電荷中性化的原因在乙酰賴氨酸殘基中胰蛋白酶的酶切位點被封住,所以乙?；目梢宰鳛槁┣挟a(chǎn)物被檢測到,其序列與未乙?；揎楇牡男蛄胁煌Ｒ阴；牡母患浅＠щy,原因在于乙?；被惠p易被衍生,因此,一般對部分純化的混合物進行乙酰化研究。這種觀點已改變了最近開展的大規(guī)模乙?；鞍缀Y選研究,通過采用樹脂結(jié)合抗體乙酰賴氨酸來富集乙?；?大量的乙酰賴氨酸位點已被定位。最近的蛋白質(zhì)組學研究中發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)乙?；碌幕瘜W物質(zhì),如O-乙酰絲氨酸和蘇氨酸殘基作為乙酰輔酶A的基團轉(zhuǎn)移產(chǎn)物,這個反應(yīng)酯化了MAP激酶的關(guān)鍵絲氨酸殘基,進而干擾了激酶和磷酸化的活化。最近在組蛋白和其他賴氨酸靶位點上賴氨酸殘基的丙酰化和丁?；延袌蟮?這揭示了賴氨酸位點的化學修飾要比以前認識的更為復雜。2.3泛素化蛋白質(zhì)的純化眾所周知,泛素和類泛素化蛋白在調(diào)控蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、活性、細胞定位及降解方面具有重要的作用。泛素是憑借泛素連接酶E3共價耦聯(lián)目標蛋白,通過異肽連接泛素C末端羧基和靶蛋白賴氨酸的ε-氨基,這些修飾對質(zhì)譜鑒定構(gòu)成了巨大的挑戰(zhàn),原因在于胰蛋白酶的酶切位點是賴氨酸和精氨酸的C端肽鍵,由于泛素化蛋白質(zhì)的賴氨酸被泛素基團保護而漏切;另外,泛素化蛋白胰蛋白酶水解可釋放甘氨酸-甘氨酸雙肽的C末端,導致賴氨酸在分子質(zhì)量上產(chǎn)生一個質(zhì)量移位為114.1u的信號。但在甘氨酸-甘氨酸共價結(jié)合賴氨酸部位胰蛋白酶裂解被抑制,產(chǎn)生漏切產(chǎn)物,其質(zhì)量范圍大于誘導活化裂解的適合范圍。目前基于多維液相色譜分離和ESI-MS/MS正被用于探究由泛素修飾或類泛素修飾蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的大肽段。在蛋白質(zhì)中有些位點會經(jīng)常發(fā)生泛素化,突變研究顯示并不是所有位點都是蛋白酶識別所需要的,這實際上削弱了調(diào)控位點在大規(guī)模研究中所需要富集來有效檢測功能性的靶位點。目前,純化泛素及類泛素化蛋白質(zhì)最直接的方法是在泛素及類似物的N端加一個多肽標簽尾巴,進而利用標簽來純化泛素及類泛素化蛋白質(zhì),缺點是標簽的加入可能影響與泛素相關(guān)修飾酶及底物蛋白的結(jié)合,泛素化抗體的出現(xiàn)將可以避免此問題發(fā)生。此外,有關(guān)泛素化和類泛素化修飾的數(shù)據(jù)庫已經(jīng)出現(xiàn),更有利于靶位點的鑒定。3定向蛋白質(zhì)組學定向蛋白質(zhì)組學是基于質(zhì)譜技術(shù)快速檢測目標蛋白的技術(shù),該技術(shù)具有靈敏度高、重復性好的特點?；谫|(zhì)譜的鳥槍蛋白質(zhì)組學研究是將蛋白質(zhì)酶解,片段化成肽片段進行質(zhì)譜分析。理論上,這種方法可以分析樣品中的所有蛋白質(zhì),但在實踐應(yīng)用中有著巨大的挑戰(zhàn)。但是對于一些不以發(fā)現(xiàn)新蛋白為研究目的,而是研究特定條件相對少量蛋白質(zhì)的變化來觀察其參與的特定相互作用或信號傳導途徑的試驗來說,可采用定向蛋白質(zhì)組學(targetedproteomics)研究策略,方法是采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(selectedreactionmonitoring,SRM)和多反應(yīng)監(jiān)測(multiplereactionmonitoring,MRM),這兩種方法本質(zhì)上是同樣的實驗模式。SRM過程是選擇一個特征性的母離子做串聯(lián)質(zhì)譜分析,在其碎片中再選擇一個特征的子離子作為監(jiān)測離子。SRM早期主要應(yīng)用于分析小分子化合物,最近才被應(yīng)用到蛋白質(zhì)組學領(lǐng)域。目前,RuediAebersold團隊致力于該技術(shù)的研究并推動其發(fā)展,他們應(yīng)用定向蛋白質(zhì)組學分析了釀酒酵母的全動態(tài)范圍的蛋白質(zhì)組,檢測到每個細胞低于50個拷貝的蛋白質(zhì),這是鳥槍蛋白質(zhì)組學不能匹敵的。有學者認為在未來的5年,定向蛋白質(zhì)組學研究將會取代蛋白質(zhì)免疫印跡雜交來進行蛋白質(zhì)表達量的驗證,該方法具有蛋白質(zhì)免疫印跡雜交的靈敏度和重復性,優(yōu)勢在于驗證特異性的速度快。蛋白質(zhì)免疫印跡定量肽可能需要花費3個月的時間,而定向蛋白質(zhì)組學分析只需要幾天。目前該方法還不能廣泛地應(yīng)用到蛋白質(zhì)組學中,主要原因在于建立用于分析全蛋白質(zhì)組學的SRM數(shù)據(jù)庫是一項非常耗時的工作。但相信隨著該技術(shù)的快速發(fā)展,將有利于高通量、高靈敏度檢測不同生物學樣品中蛋白質(zhì)的鑒定和定量分析。4質(zhì)譜的組學研究蛋白質(zhì)組學研究中有兩個不同的基本方法:其一是基于表達的蛋白質(zhì)組學研究,主要利用傳統(tǒng)的雙向電泳技術(shù)研究細胞、組織、器官或不同生物系統(tǒng)對外界刺激或不同病理狀態(tài)下所表達的所有蛋白質(zhì)。雖然該方法在一些研究中已取得了成功,但是仍存在著一些弊端,如生物系統(tǒng)中蛋白質(zhì)表達的動態(tài)范圍問題,往往一些調(diào)控蛋白因其表達量很低而被高豐度蛋白所掩蓋;遺傳和環(huán)境的變異導致基因和蛋白質(zhì)表達的多變性,給基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組定量研究帶來困難;此外,翻譯后修飾在調(diào)控細胞生物過程中有著重要的作用,但是目前可用的技術(shù)很難全面和定量地進行分析。其二是功能蛋白質(zhì)組學研究,與表達蛋白質(zhì)組相學比有著根本和策略上的不同。利用基于質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學方法鑒定細胞、亞細胞或有機體蛋白質(zhì),并闡明對細胞生物過程和信號傳導途徑一些重要見解。大部分細胞的功能是由蛋白質(zhì)復合物來執(zhí)行和完成的。目前有多種不同的技術(shù)方法來研究功能蛋白質(zhì)組學,如親和純化和表面等離子共振技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、酵母雙雜交和噬菌體展示技術(shù)及計算機模擬技術(shù)等。通過這些方法所獲得的數(shù)據(jù)需要用質(zhì)譜技術(shù)進行鑒定與已知蛋白相互作用的未知蛋白質(zhì),其可以在幾個小時內(nèi)鑒定數(shù)千種蛋白質(zhì),并結(jié)合生物信息學對數(shù)據(jù)進行整合和解釋?；谫|(zhì)譜的功能蛋白質(zhì)組學在相關(guān)生理背景條件下利用現(xiàn)代靈敏的質(zhì)譜技術(shù)來差異分析蛋白質(zhì)復合物進而闡明蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用,例如,利用功能蛋白質(zhì)組學系統(tǒng)分析了酵母細胞的蛋白質(zhì)復合物的組成并獲得了前所未有的蛋白質(zhì)相互作用的大量信息。功能蛋白質(zhì)組學最終的目的是通過生成一個總體規(guī)劃來描述所有的分子、分子的功能、外界刺激的反應(yīng)及相互關(guān)系來破譯整個細胞的分子功能。然而,基于質(zhì)譜的功能蛋白質(zhì)組學的成功應(yīng)用還遠未達到,原因在于未能捕獲感興趣的蛋白質(zhì)復合物、質(zhì)譜分析中有限的動態(tài)范圍和靈敏度、譜圖的不完整解釋及數(shù)據(jù)庫檢索中無法進行數(shù)據(jù)的大量分析等。雖然存在著一些問題,但隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展,基于質(zhì)譜的功能蛋白質(zhì)組學將可以作為了解感興趣靶蛋白生物功能的常規(guī)工具,并提供較多的機會來尋找潛在的新的靶標蛋白質(zhì)。5白質(zhì)組學信息質(zhì)譜分析所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)解讀和分析是基于質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學研究的一項重大挑戰(zhàn),也是許多蛋白質(zhì)組研究計劃的瓶頸?；诖?lián)質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學信息,是通過蛋白酶酶解多肽混合物后進入多維液相色譜預分離,在一級質(zhì)譜中進行肽段離子化,被選的母離子在碰撞室內(nèi)經(jīng)碰撞誘導解離片段化所產(chǎn)生子離子片段離子譜而獲得的。如何正確地根據(jù)獲得的肽譜確定肽序列是蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)處理的首要步驟。目前已有大量的計算方法和軟件工具可自動化地根據(jù)肽譜確定肽序列,大體可以分為3類:數(shù)據(jù)庫檢索、從頭測序和“混合”方法。5.1分子質(zhì)量/能量匹配系統(tǒng)通過質(zhì)譜的肽離子譜獲得的肽序列與數(shù)據(jù)庫中已有的預測的理論蛋白質(zhì)序列比對進行蛋白質(zhì)的鑒定。目前已有許多串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索的搜索引擎,它們的工作方式是通過輸入肽片段離子的m/z(質(zhì)量/電荷比值),根據(jù)數(shù)據(jù)庫中已有的理論肽片段的模式進行計算分值?；谝幌盗械臋z索標準如質(zhì)量誤差范圍﹑選擇使用的酶和翻譯后的修飾類型等獲得了一些候選蛋白質(zhì)。程序所輸出的是一系列依據(jù)評分標準獲得的與片段離子匹配的肽序列。目前國際上常用的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫主要有SWISS-PROT、TrEMBL、PIR-PSD和UniPro等。5.2基于數(shù)據(jù)庫檢索的從頭測序根據(jù)肽離子譜直接明確地讀取肽序列稱為從頭測序。最初這項工作是人工完成的,但最近幾年一系列工具的開發(fā)已可輔助研究者完成從頭測序任務(wù)。從頭測序優(yōu)于數(shù)據(jù)庫檢索體現(xiàn)在可以確切鑒定肽的序列,還